Calcium effect on dynamics and stability of KV7.2 channel

Resumen

La familia Kv7 controla la excitación celular en diferentes tejidos, por lo que es importante investigar su fisiología y fisiopatología. Se relaciona con enfermedades como la epilepsia, encefalopatías, arritmias, diabetes y sordera, entre otras. Todos los miembros de la familia Kv7 muestran una estructura muy similar en relación con la función. Esta homología hace que los avances en la investigación de un miembro Kv7 puedan aplicarse generalmente a los demás. La regulación de Kv7.2 es muy compleja. Por un lado, está claro que los senderos de señalización dependen de muchas variables, como los receptores acoplados a la proteína Gq/11 pueden producir una inhibición diferente por la compartimentalización y colocación espacial de las zonas de señalización. Por otra parte, pequeñas moléculas, como el PIP2 y el Ca2+, pueden modular la corriente. Además hay otras proteínas imprescindibles para la función adecuada de Kv7.2: la CaM, encargada de la señalización del calcio y el transporte del canal; la ancarnina, que gestiona la localización neuronal; y la sintaxina, proteína que puede aumentar la síntesis de los canales Kv7 o reducir la degradación/renovación. Esta tesis está enfocada en entender como el calcio afecta en la estabilidad y la dinámica de los canales Kv7, empleando técnicas biofísicas como FRET, RMN, HS-AFM y Dicroismo circular. Hemos comprobado que el cambio conformacional previamente descrito para el monómero del canal se mantiene también en el tetrámero. Además, se observa que el calcio aumenta la estabilidad del canal. En cuanto a la señalización por calcio se demuestra que el linker dentre las hélices A y B del canal desempeña un papel en la transducción de señal de Ca2+. La longitud y la composición del enlazador favorecen los cambios conformacionales en función de Ca2+. Se demuestra también que la calmodulina confiere sensibilidad al calcio a la estabilidad del dominio de ensamblaje de la hélice D intracelular distal de los canales Kv7.2. La formación de ensamblajes tetraméricos dependientes de la hélice distal D influye en la unión de CaM y en las propiedades Kv7.2 dependientes de CaM. Recíprocamente, CaM y Ca2+ influyen en el comportamiento dinámico de la bobina helicoidal D helicoidal. Además, se comprueba que en ausencia de actividad metabólica, la calmodulina permanece unida de manera estable a las hélices A y B dentro de la CRD (calcium regulation domain) durante al menos 30 minutos.Se demuestra que Los cambios conformacionales impulsados por Ca2+ en el dominio sensible al calcio (CRD) de los canales Kv7.2 implican una rotación del lóbulo C de CaM y una separación de las hélices A y B. La influencia La tetramerización dependiente de la hélice D no influye en dicho cambio. Este cambio conformacional se canaliza por la interacción directa de este catión con la mano E-F (3), mientras que la unión de Ca2+ a la E-F (4) tiene una influencia pequeña, pero significativa. Por último, se demuestra que el conector S2/S3 de los Kv7 interactúa con el lóbulo C de CaM en solución, principalmente a través de la mano E-F (3) e invierten los cambios conformacionales dependientes de Ca2+ en el CRD.( // La familia Kv7 controla la excitación celular en diferentes tejidos, por lo que es importante investigar su fisiología y fisiopatología. Se relaciona con enfermedades como la epilepsia, encefalopatías, arritmias, diabetes y sordera, entre otras. Todos los miembros de la familia Kv7 muestran una estructura muy similar en relación con la función. Esta homología hace que los avances en la investigación de un miembro Kv7 puedan aplicarse generalmente a los demás. La regulación de Kv7.2 es muy compleja. Por un lado, está claro que los senderos de señalización dependen de muchas variables, como los receptores acoplados a la proteína Gq/11 pueden producir una inhibición diferente por la compartimentalización y colocación espacial de las zonas de señalización. Por otra parte, pequeñas moléculas, como el PIP2 y el Ca2+, pueden modular la corriente. Además hay otras proteínas imprescindibles para la función adecuada de Kv7.2: la CaM, encargada de la señalización del calcio y el transporte del canal; la ancarnina, que gestiona la localización neuronal; y la sintaxina, proteína que puede aumentar la síntesis de los canales Kv7 o reducir la degradación/renovación. Esta tesis está enfocada en entender como el calcio afecta en la estabilidad y la dinámica de los canales Kv7, empleando técnicas biofísicas como FRET, RMN, HS-AFM y Dicroismo circular. Hemos comprobado que el cambio conformacional previamente descrito para el monómero del canal se mantiene también en el tetrámero. Además, se observa que el calcio aumenta la estabilidad del canal. En cuanto a la señalización por calcio se demuestra que el linker dentre las hélices A y B del canal desempeña un papel en la transducción de señal de Ca2+. La longitud y la composición del enlazador favorecen los cambios conformacionales en función de Ca2+. Se demuestra también que la calmodulina confiere sensibilidad al calcio a la estabilidad del dominio de ensamblaje de la hélice D intracelular distal de los canales Kv7.2. La formación de ensamblajes tetraméricos dependientes de la hélice distal D influye en la unión de CaM y en las propiedades Kv7.2 dependientes de CaM. Recíprocamente, CaM y Ca2+ influyen en el comportamiento dinámico de la bobina helicoidal D helicoidal. Además, se comprueba que en ausencia de actividad metabólica, la calmodulina permanece unida de manera estable a las hélices A y B dentro de la CRD (calcium regulation domain) durante al menos 30 minutos.Se demuestra que Los cambios conformacionales impulsados por Ca2+ en el dominio sensible al calcio (CRD) de los canales Kv7.2 implican una rotación del lóbulo C de CaM y una separación de las hélices A y B. La influencia La tetramerización dependiente de la hélice D no influye en dicho cambio. Este cambio conformacional se canaliza por la interacción directa de este catión con la mano E-F (3), mientras que la unión de Ca2+ a la E-F (4) tiene una influencia pequeña, pero significativa. Por último, se demuestra que el conector S2/S3 de los Kv7 interactúa con el lóbulo C de CaM en solución, principalmente a través de la mano E-F (3) e invierten los cambios conformacionales dependientes de Ca2+ en el CRD.(