Desarrollo de un método inmunoquímico para la detección y cuantificación de esporos de clostridium tyrobutyricum en leche

Abstract

La fermentación butírica es un grave problema en la fabricación de queso, que se manifiesta a lo largo de la maduración y provoca un defecto conocido como la "hinchazón tardía", y que provoca importantes pérdidas económicas en la industria quesera. El principal agente responsable de la fermentación butírica es Clostridium tyrobutyricum. La velocidad de aparición de la hinchazón tardía, así como la proporción de quesos afectados, está estrechamente ligada al número ,de esporos de este microorganismo, presentes inicialmente en la leche. Actualmente, el método de detección de referencia es el método del número más probable, pero es un método laborioso, inespecífico y lento. Por ello, sería útil disponer de un método para la detección de los esporos en la leche, antes de destinarla a la elaboración del queso, dado que la presencia de esporos de Clostridium tyrobutyricum no produce problemas en otros productos lácteos. En esta tesis, se han obtenido antisueros anti-esporos de Clostridium tyrobutyricum de especificidad elevada mediante la inoculación de esporos completos tanto en conejos como en ovejas. En esta etapa, se estudió el efecto de diversos tratamientos de los esporos en sü inmunogenicidad, observando que el tratamiento por calor aplicado a los esporos de Clostridium tyrobutyricum favorece la respuesta inmune, principalmente en las primeras inmunizaciones. Una vez obtenidos los antisueros, los anticuerpos específicos se aislaron mediante inmunoadsorción para su posterior aplicación en la detección de los esporos. También se ha caracterizado la proteína de los esporos de Clostridium tyrobutyricum, mayoritariamente reconocida por los anticuerpos. Esta proteína, se encuentra tanto en las formas vegetativas como en los esporos, y tiene alta homología de secuencia con algunas proteínas de la familia de las chaperonas del género Clostridium. Además de los anticuerpos, se han obtenido trece ligandos peptídicos específicos y afines por los esporos de Clostridium tyrobutyricum a partir de una biblioteca de péptidos expresados en fagos (Phage display). El péptido que hemos denominado pCTS1, es, de los trece péptidos, es el más afín por los esporos. Este péptido fue sintetizado para su posterior aplicación en la separación y detección de los esporos. Una vez obtenidos los ligandos específicos para los esporos de Clostridium tyrobutyricum, se ha desarrollado un método de separación biomagnética de los esporos en suspensión, tapizando esferas superparamagnéticas con dichos ligandos. Se ha comprobado que tanto los anticuerpos como los péptidos, son apropiados para la separación de los esporos de Clostridium tyrobutyricum a partir 4e una suspensión acuosa. Sin embargo, el tamaño de las esferas paramagnéticas, tapizadas con anticuerpos específicos anti-esporos, influye en la capacidad de separación de éstos, siendo las de 200 nm de diámetro las más efectivas, con las que se recuperaron un porcentaje de esporos por encima del 90%. Además, es importante la orientación final de los anticuerpos en las esferas para obtener una óptima separación de los esporos. En este caso, el tapizado covalente de las esferas derivatizadas con grupos amino a través de los carbohidratos de la región Fc de las inmunoglobulinas, fue el método más apropiado. Las esferas tapizadas con el péptido pCTS 1 también fueron muy efectivas en la separación de los esporos de Clostridium tyrobutyricum, obteniendose de nuevo porcentajes de recuperación de esporos por encima del 90%. La mayor estabilidad del ligando peptídico, más resistente a cambios de orientación en la superficie de las esferas, lo hace más adecuado que los anticuerpos para su utilización en la separación biomagnética. Además, utilizando el péptido pCTS 1 biotinilado como marcador, este método permite detectar los esporos de Clostridium tyrobutyricum separados con las esferas paramagnéticas desde una concentración de 1000 esporos/mL en una suspensión acuosa. Además de la separación biomagnética se ha desarrollado un método de detección de los esporos por citometría de flujo. Se han establecido los parámetros de dispersión de luz y fluorescencia para la detección de los esporos de Clostridium tyrobutyricum, mediante la utilización de anticuerpos conjugados con fluoresceína o Alexa Fluor 488. Estos parámetros permiten, además de la detección de los esporos de Clostridium tyrobutyricum, su diferenciación de los esporos de otros microorganismos del mismo género. De los dos fluorocromos estudiados, el fluorocromo Alexa Fluor 488 fue el mejor marcador para la detección mediante citometría de flujo, dado que permite mayores restricciones en la intensidad de fluorescencia. Este método citométrico, tras la aplicación de un tratamiento preliminar de una muestra de leche, y la concentración de los esporos por centrifugación, permite detectar desde 1000 esporos en 100 mL de leche en un tiempo total inferior a 2 horas.