Caracterización de las subunidades de unión a nucleótido del transportador ABC de nitrato/nitrito de la cianobacteria phormidium laminosum

Resumen

En cianobacterias el nitrato/nitrito se transportan al inferior celular mediante un transportador "ATP-binding cassette" (ABC) denominado NRT, compuesto por cuatro subunidades proteicas: NrtA (subunidad periplásmica responsable de la unión del nitrato/nitrito), NrtB (subunidad transmembranal), NrtC y NrtD (subunidades de unión a nucleótido). En la cianobacteria filamentosa, termófila y no fijadora de nitrógeno, Phormidium laminosum se habían identificado los genes nrtA, nrtB y nrtC, que codifican el transportador ABC de nitrato/nitrito, formado parte del operón nir, junto con el gen mirA, que codifica la nitrito reductasa. En este trabajo se ha identificado el gen nrtD, a continuación de mrtC, formando parte del operón nir. La subunidad NrtC del transportador de nitrato/nitrito de P.laminosum se ha purificado a partir de células deficientes en nitrógeno y se ha comprobado que hidroliza ATP in vitro, en ausencia del resto de componentes del transportador. Los genes nrtC y nrtD se han clonado en plásmidos de expresión pQE-9 y se han expresado en E.coli, purificándose como proteínas de fusión a cola de histidinas. Se han caracterizado las subunidades His6NrtC e His6NrtD por su capacidad para catalizar la hidrólisis de ATP, con respecto a su especificidad por varios sustratos y sensibilidad a inhibidores, demostrándose la que ambas proteínas hidrolizan ATP in vitro. Además, mediante elctroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes se ha detectado la formación de homodímeros de NrtC, His6NrtC e His6NrtD. La formación de homodímeros de His6NrtD también se ha comprobado por espectrometría de masas MALDI-TOF.