Nuevas aplicaciones de la resonancia magnética nuclear al estudio de interacciones proteína carbohidrato. New nmr applications to the study of protein carbohydrate interactions

Abstract

La superficie de la mayoría de las células está cubierta por una capa de glicanos ("glicocálix¿) formada por proteínas y lípidos glicosilados insertados en la bicapa lipídica. La glicosilación consiste en la adición de carbohidratos (glicanos) a macromoléculas citosólicas o unidas a membrana. En la naturaleza existen dos reacciones de glicosilación principales que dan lugar a conjugados N- y O-glicosilados. Los glicoconjugados están involucrados en eventos de reconocimiento molecular fisiológicos y patológicos. Para poder monitorizar estos procesos es esencial conocer en detalle las características del reconocimiento. Por tanto, en esta tesis se han desentrañado las propiedades conformacionales de N-glicanos complejos en disolución (en estado libre y unidos a receptores). Se ha empleado un enfoque novedoso de espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) basado en los efectos paramagnéticos inducidos por lantánidos mediante el uso de agentes quelantes de metales. 1. RMN paramagnética aplicada a la caracterización conformacional de N-glicanos de tipo complejo 1.1. Caracterización por RMN de un N-glicano bi-antenario bisectado con un motivo estructural de N-acetilglucosamina galactosilada La determinación del patrón de glicosilación de la Inmunoglobulina G (IgG), el anticuerpo más abundante en el suero humano, es crucial para comprender su participación en las respuestas inmunitarias. En concreto, la presencia de un residuo de N-acetil-glucosamina (GlcNAc) bisectado en la IgG es objeto de estudio en la terapéutica de anticuerpos. En esta tesis, se caracterizó un N-glicano bi-antenario bisectado con un residuo de GlcNAc galactosilado. Los resultados revelan que el equilibrio conformacional se reduce respecto al derivado no bisectado. Esta modificación afecta a las conformaciones preferentes de los N-glicanos y puede modular su interacción con receptores. Además, es exclusiva de los glicanos bi-antenarios e impide la introducción de nuevas ramas a la estructura central del glicano. 1.2. Caracterización por RMN del comportamiento conformacional de una familia de N-glicanos tetra-antenarios, así como de las propiedades de su reconocimiento molecular frente a galectinas humanas En esta tesis, se aplicó la metodología de RMN paramagnética para estudiar una familia de N-glicanos multi-antena (bisectados, fucosilados y glicanos con ambas modificaciones). Los resultados señalan que el GlcNAc bisectado, a diferencia de la fucosa, cambia la distribución conformacional de las ramas, provocando un aumento de geometrías plegadas. Los N-glicanos complejos y ramificados están fuertemente asociados al cáncer. Por ello, también se estudió la interacción entre estos N-glicanos y las galectinas humanas 3 y 4. Los resultados revelan que no existe selectividad de unión para las diferentes ramas y, además, que los glicanos están preorganizados para el reconocimiento molecular. 2. Diseño de una nueva metodología de RMN para medir las afinidades de unión relativas de glicanos complejos en la infección del virus de la gripe Los glicanos también están involucrados en la infección del virus de la gripe, una gran amenaza para la salud. Comprender las bases moleculares de estos procesos es crucial para diseñar nuevos fármacos y prevenir futuras pandemias. El reconocimiento de N-glicanos sialilados por la Hemaglutinina (HA) del virus de la gripe, que supone el inicio de la infección viral, se estudió mediante la evaluación de dos cepas (A/Taiwán/2/13 H6N1 y A/California/04/09 H1N1). Se comparó su selectividad por dos trisacáridos sialilados (alfa-2,3 y alfa-2,6 sialil-lactosa) y dos N-glicanos bi-antenarios y sialilados de diferente longitud. Los resultados demuestran que las HAs con una mayor adaptación para infectar a humanos han desarrollado especificidad por cadenas largas de N-glicano.