Chemical tools to investigate the role of sphingolipids in disease

Resumen

Evidencias experimentales sugieren un papel de las dihidroceramidas (dhCer) en la inducción de la autofagia, pero si las dhCer conducen a autofagia protectora o letal es objeto de controversia. Por otro lado, a pesar de los avances en el desarrollo de sondas basadas en actividad (ABP) para el marcaje de la ceramidasa ácida (AC), todavía hay una clara necesidad de desarrollar herramientas más específicas y potentes para caracterizar la actividad de la AC en las células. En este contexto, los objetivos de este trabajo de tesis son: 1. Validar el papel de las dhCer como mediadores de la inducción de autofagia en modelos celulares de cáncer. Para llevar a cabo éste objetivo, se ha procedido a aumentar los niveles de dhCer mediante el uso de dos tipos diferentes de herramientas farmacológicas: precursores metabólicos y inhibidores de la Dihidroceramida desaturasa (Des1). En la primera aproximación, se utilizó cetoesfinganina (KSa) y su análogo dideuterado en C4 (d2KSa) como precursores metabólicos de dhCer. Tanto la KSa como la d2KSa se metabolizaron para producir altos niveles de dihidroesfingolípidos (dhSLs) en las líneas celulares tumorales HGC27, T98G y U87MG. Experimentos realizados a diferentes tiempos de tratamiento sugieren que la esfinganina, la esfinganina-1-fosfato y la dihidroceramida son probablemente los mediadores de la autofagia producida tras el tratamiento con d2KSa. La inhibición de la Des1 observada con estas 3-cetobases es causada por su metabolización a dihidroceramida. En la otra aproximación dirigida a estudiar el papel de las dhCer en la activación de la autofagia se utilizaron compuestos inhibidores de la Des1 cómo gamma-tocotrienol ( TE) y XM462, capaces de incrementar los niveles intracelulares de dhCer, en las líneas de glioblastoma U87MG y T98G. Todos los compuestos estudiados excepto el gamma tocoferol ( T) indujeron el flujo autofágico de forma concomitante con la acumulación de dhCer, la cual ocurrió por estimulación de la biosíntesis de novo y disminución de la actividad Des1. 2. Desarrollar una sonda basada en la actividad enzimática (ABP) para la detección de ceramidasa ácida (AC). En éste estudio, se ha analizado la actividad de diferentes análogos del SABRAC. Estos compuestos son inhibidores potentes de la AC y además presentan diferentes grupos funcionales o fluorescentes que permiten su uso como ABP para el análisis de enzima activa. Los dos compuestos han sido efectivos para la detección de AC en lisados celulares.