Mecanismos de resistencia a azoles en especies de candida no-albicans

Resumen

En los últimos años los importantes avances en el campo de la medicina han permitido aumentar la supervivencia y alargar la vida de muchos pacientes, pero como resultado estos se convierten en especialmente vulnerables a las infecciones fúngicas, en muchos casos asociadas a un alta tasa de mortalidad, Candida y Aspergillus ocupan posiciones relevantes en este tipo de infecciones. La candidiasis invasora es una infección micótica de gran importancia clínica causada por varias especies de Candida. Aunque la más común es Candida albicans, en los últimos años ha habido un aumento de infecciones producidas por otras especies tales como Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida tropicalis y Candida krusei, sin embargo, la prevalencia de estos organismos varía considerablemente, dependiendo de las diferentes regiones geográficas. Las candidiasis son responsables del 90% de las micosis invasoras a nivel mundial, y su espectro clínico varía desde una candidemia mínimamente sintomática hasta una sepsis fulminante con una elevada mortalidad. Candida es un organismo comensal común en la piel y en la microbiota intestinal. Posibles alteraciones en las barreras cutáneas y gastrointestinales promueven la enfermedad invasiva. El diagnostico precoz de estas infecciones es clave para la elección del tratamiento terapéutico adecuado. Los medicamentos de primera línea utilizados son las equinocandinas y los azoles, sin embargo, el incremento en la aparición de cepas resistentes a los antifúngicos es uno de los principales problemas de estas infecciones, además del número limitado número de antifúngicos disponibles. En la actualidad los azoles son los más frecuentemente usados en el tratamiento de la candidiasis, debido a su baja toxicidad y a su posibilidad de ser administrados por la vía oral. Debido a que en los últimos años va aumentando el número de cepas de Candida resistentes a azoles, es esencial comprender mejor los mecanismos involucrados en dichos procesos para intentar mejorar el tratamiento de dichas infecciones. Si bien se ha reportado resistencia a los azoles en todas las especies de Candida de relevancia clínica, el incremento de infecciones graves emergentes por Candida no-albicans resistentes (adquirida o intrínseca) a los azoles es visto con preocupación. Se han descrito y demostrado diversos mecanismos de resistencia en Candida spp. la mayoría de estudios en C. albicans, sin embargo los estudios que incluyen especies emergentes son escasos pese a la relevancia éstas en la epidemiología global de la candidiasis. En esta tesis doctoral se estudiaron mecanismos de resistencia a azoles de algunas de las especies más prevalentes de Candida no-albicans, como C. parapsilosis, C. glabrata y C. tropicalis base a ello se plantearon los siguientes objetivos. Objetivo principal: - Estudiar las bases moleculares de la sensibilidad reducida de Candida no-albicans a los azoles y evaluar la eficacia de determinadas terapias, basadas en dichos compuestos, para el tratamiento de las candidiasis. Objetivos secundarios: - Identificar mutaciones en el gen ERG11 en cepas de C. glabrata, C. tropicalis y C. parapsilosis relacionadas con la sensibilidad reducida al voriconazol. - Estudiar el papel de los genes CDR1, CDR2, SNQ2 y ERG11, en la resistencia al voriconazol, de las especies C. glabrata, C. tropicalis y C. parapsilosis mediante estudios de expresión génica. - Estudiar la expresión de los genes CDR1, CDR2, SNQ2 y ERG11, directamente implicados en la resistencia al voriconazol, de las especies C. glabrata, C. tropicalis y C. parapsilosis. Para llevar a cabo los objetivos propuesto se seleccionaron cepas de C. glabrata, C. tropicalis y C. parapsilosis de origen clínico suyas CMIS de voriconazol fueran representativas de toda la escala. Para la determinación de CMIs se utilizó el método de microdilución del CLSI. Además de desarrollaron modelos animales de infección con el objetivo de correlacionar la eficacia terapéutica de VRC con los datos moleculares e in vitro obtenidos. Estudios in vitro. Para la determinación de CMIs se utilizaron microplacas de 96 pocillos con concentraciones dobles seriadas de los fármacos ensayados (azoles), según los documentos de referencia del CLSI. Además se realizaron estudios fenotípicos de crecimiento de los aislados en presencia de diferentes componentes tóxicos que afectan a la membrana y pared fúngica, Calco Fluor White (CFW), Congo Red (CR) y Dodecilsulfato Sódico (SDS) y se llevó la extracción de esteroles totales de la membrana fúngica mediante el uso de hidróxido potásico y n-hepatano. Estudios in vivo. Todos los estudios se realizaron en ratones OF-1 inmunosuprimidos (200 mg/kg i.p. cada 5 días) infectados con una suspensión de levaduras por la vena lateral de la cola. Los tratamientos con voriconazol (40 mg/kg), posaconazol (25 mg/kg, dos veces al día) y itraconazol (50 mg/kg), por via oral en los 3 casos, empezaron un día después de la infección, y duraron10 días y su se evaluó mediante estudios de supervivencia y de carga fúngica. Estudios moleculares. La identificación de mutaciones en el ERG11, gen que codifica la 14-α-desmetilasa del lanosterol, y diana de los azoles, como responsables de la resistencia a VRC en las cepas sometidas a estudio, se realizó mediante la secuenciación y comparación de sus secuencias con aquellas de referencia. Para la comparación y análisis de secuencias se utilizó el paquete bioinformatico Lasergene. Mediante PCR a tiempo real se determinó la expresión relativa de CDR1, CDR2, SNQ2 que codifican bombas transportadoras de membrana, y ERG11, utilizando como housekeeping o gen de referencia, RDN 5.8 o ACTINA 1. Los datos se analizaron con los software StepOne vs 2.3 y Excel de Windows. El análisis estadístico de los resultados de eficacia in vivo y de los estudios moleculares de mecanismos de resistencia se llevó a cabo con GraphPad Prism versión 6.0 para Windows, utilizando los métodos de Método de Kaplan Meier, Test U de Mann-Whitney y ANOVA de 1 factor. Los resultados demostraron una limitada relación de los genes ERG11, CDR1, CDR2, SNQ2 en la resistencia de C. glabrata al voriconazol, además en el primero de ellos únicamente se encontró mutaciones sinónimas sin relación con la resistencia a dicho antifúngico . Se puso de manifiesto el importante papel desempeñado por los genes CDR1, en la resistencia in vivo, y ERG11, in vitro, respectivamente, de C. parapsilosis al voriconazol. Las mutaciones puntuales de las cepas de C. parapsilosis encontradas en el gen ERG11, no estaban relacionadas con la resistencia a fármaco. En cuanto a C. tropicalis se observó que el gen ERG11 era inducible por el voriconazol in vitro, pero no se demostró una relación directa entre sus niveles de expresión y las CMIs de dicho antifúngico. Así mismo, en esta especie se encontró una mutación en ERG11 en un aislado resistente, que se traducía en una la pérdida de 126 aminoacidos en la 14-α-desmetilasa del lanosterol lo que parece demostrar que dicha mutación estaría potencialmente asociada a la resistencia al voriconazol.