Derivados multivalentes de triptófano como inhibidores duales de la replicación de VIH y EV71

Resumen

En la presente tesis doctoral se describe el diseño, síntesis y evaluación biológica de compuestos multivalentes de triptófano con actividad dual frente al Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) y Enterovirus 71 (EV71). Estos compuestos se han preparado a partir de un compuesto prototipo, AL-385 (PM = 3575.84 Da), descubierto en nuestro grupo de investigación, que posee un esqueleto central de pentaeritritol, cuatro espaciadores trivalentes y doce triptófanos con sus ácidos libres en la periferia. AL-385 mostró actividad micromolar frente a VIH y nanomolar frente a cepas clínicas de EV71 aisladas de pacientes. El objetivo global del trabajo llevado a cabo es determinar los requisitos estructurales necesarios para la actividad, así como obtener compuestos más activos y menos tóxicos que el prototipo. Para ello se llevaron a cabo modificaciones tanto en la periferia como en los espaciadores presentes en AL-385. En concreto, en el trabajo descrito en el capítulo 1 se sustituyeron los residuos de triptófano de la periferia por otros aminoácidos no aromáticos, como alanina y aromáticos como fenilalanina y tirosina. Además, se llevó a cabo la síntesis de un derivado de triptamina (análogo de triptófano sin grupo ácido) y un derivado N-Metilado de triptófano. Los resultados biológicos mostraron que tan solo el derivado de tirosina y N-Metil triptófano resultaron activos, tanto frente a EV71 como frente a VIH, lo que demuestra que la naturaleza del aminoácido desempeña un papel importante en la actividad. Por otro lado, el derivado de triptamina resultó inactivo frente a ambos virus, lo que sugiere que los ácidos libres en la periferia son cruciales para la actividad. Estudios de resonancia de plasmón de superficie llevados a cabo con los derivados más activos (tirosina y N-Metil Trp) revelaron que ambos compuestos, al igual que el prototipo AL-385, son capaces de interaccionar con las glicoproteínas gp120 y gp41, de la superficie del VIH. Ambos dendrímeros mostraron actividad nanomolar frente a cepas clínicas de EV71 aisladas de pacientes al igual que el prototipo. Ensayos de tiempo de adición llevados a cabo con el derivado de tirosina mostraron que dicho dendrímero actúa en etapas tempranas del ciclo replicativo del EV71. En el trabajo descrito en el capítulo 2 se sustituyeron los espaciadores trivalentes, presentes en el prototipo AL-385, por otros bi- y tetravalentes con el fin de estudiar la influencia en la actividad tanto del número de triptófanos como su disposición en el espacio. Los resultados biológicos frente a VIH revelaron que los compuestos con espaciadores bivalentes y tetravalentes mostraron actividad similar a la del prototipo (con espaciadores trivalentes), de lo que se deduce que la naturaleza del espaciador no desempeña un papel crucial en la actividad frente a VIH. Además, los datos biológicos indican que existe un número óptimo de triptófanos para la actividad, por encima del cual no se observa mejora en la actividad. Los dendrímeros con espaciadores bivalentes resultaron inactivos frente a EV71 mientras que los que presentan espaciadores tetravalentes resultaron tan activos como el prototipo. Además, los dendrímeros con espaciadores tetravalentes mostraron actividad significativa frente al Virus Herpes Simplex tipo 2 (HSV-2). Este resultado es de especial interés ya que el HSV-2 facilita la transmisión del VIH y aumenta su virulencia por lo que en la actualidad existe un gran interés en la búsqueda de compuestos con actividad frente a ambos virus. En el trabajo descrito en el capítulo 3 nos propusimos llevar a cabo la síntesis de compuestos de menor peso molecular que el prototipo que mantuvieran la actividad frente a VIH y EV71. Para ello decidimos sintetizar trímeros y tetrámeros en los que se eliminaron los espaciadores trivalentes presentes en el prototipo y se unieron los residuos de triptófano directamente al esqueleto central. Debido a que dichos compuestos resultaron inactivos frente a ambos virus, decidimos sintetizar derivados sustituidos en las posiciones N1, C2 y C7 de los anillos de indol con anillos aromáticos portadores de diferentes grupos funcionales. Para la sustitución en N1 utilizamos reacciones de alquilación convencionales mientras que para las arilaciones en C2 y C7 se emplearon reacciones de acoplamiento cruzado catalizadas por paladio. Los resultados biológicos revelaron que tan solo los compuestos modificados en las posiciones C2 y C7 con fenilos portadores de uno o dos ácidos carboxilicos resultaron activos frente a VIH y EV71. Merece la pena destacar que algunos compuestos de esta serie resultaron entre 3 y 100 veces más activos frente a VIH que el prototipo AL-385, mientras que frente a EV71 mostraron similar actividad y menor toxicidad. En consecuencia, el índice terapéutico (relación toxicidad/actividad) de dichos compuestos fue considerablemente superior al del prototipo mientras que su peso molecular fue muy inferior, lo que podría contribuir a mejorar sus propiedades farmacocinéticas. El prototipo de esta nueva serie de compuestos es el trímero AL-470 (PM = 1328.20 Da), con tan solo 3 triptófanos en su estructura, modificados en la posición C2 del indol con fenilos portadores de dos ácidos carboxílicos. En el capítulo 4 se describen diferentes ensayos biológicos para estudiar el mecanismo de acción frente a EV71 de los dos prototipos, AL-385 (dendrímero) y AL-470 (trímero), descubiertos hasta el momento. Estudios de tiempo de adición revelaron que ambos compuestos inhiben etapas tempranas del ciclo replicativo de EV71. Otros ensayos biológicos (termo-estabilidad, resistencia cruzada, generación-selección-caracterización de cepas virales resistentes) sugieren que ambos prototipos se comportan como la suramina, un inhibidor de entrada con carga negativa, que debe su acción inhibitoria a la interacción con la región de carga positiva de la proteína estructural VP1 de la cápsida viral. Para tener más información acerca del sitio de unión del trímero prototipo AL-470, decidimos llevar a cabo estudios de fluorescencia mediante la síntesis de un derivado fluorescente de dicho trímero. Desafortunadamente estos resultados no fueron concluyentes Desafortunadamente estos resultados no fueron concluyentes Finalmente, se preparó la sal sódica de AL-470 con la que se están llevando a cabo estudios in vivo en un modelo de ratón infectado por EV71.