Eines per a l´estudi del metabolisme i els efectes dels esfingolípids

Resumen

Los esfingolípidos son lípidos complejos derivados de la esfingosina (So) que, además de servir como base estructural de las membranas celulares, regulan múltiples vías de señalización. La ceramida (Cer), con función pro-apoptótica, y la esfingosina-1-fosfato (S1P), anti-apoptótica, se encuentran entre los esfingolípidos con un papel más determinante en la regulación de la homeostasis celular. Por este motivo, las enzimas involucradas en la formación o hidrolisis de estas especies de esfingolípidos tienen un papel clave en la determinación del destino celular. Entre estas enzimas destacan las ceramidasas (CDasas), que hidrolizan Cer para generar So, que es el único precursor de la S1P. La investigación en el campo de las CDasas ha estado obstaculizada por la falta de sustratos e inhibidores específicos para estas enzimas. Por este motivo, el primer objetivo de esta tesis consistió en desarrollar sustratos e inhibidores específicos de CDasas que fuesen activos en células intactas. Por lo que a sustratos refiere, para evaluar la actividad de las diferentes CDasas, el sustrato fluorogénico RBM14C12 estaba descrito como el más eficiente para la CDasa ácida (AC), mientras que el RBM14C16 lo estaba para la CDasa neutra (NC) y la alcalina 3 (ACER3). Se sintetizaron otros compuestos RBM14 y la familia de compuestos RBM15, con un grupo vinil que los hacía más semejantes a las Cer naturales. Ninguno de los nuevos compuestos RBM14 o RBM15 resultó superior al RBM14C12 como sustrato de la AC, mientras que el RBM14C24:1 fue un sustrato eficiente y selectivo para la NC, tanto en proteína recombinante (rhNC) como en lisados celulares y en células intactas. Los nuevos compuestos RBM14 no fueron sustratos de ninguna de las tres ACER. Se determinó que los compuestos RBM15 con cadenas N-acil largas e insaturadas (18:1 y 22:1) pueden ser utilizadas para medir actividades ACER1 y ACER2, siendo prácticamente estables frente a la ACER3. Con respecto a la investigación de inhibidores de CDasas, el cribaje de compuestos resultó en el descubrimiento de inhibidores de ACER3 altamente selectivos en células intactas. Los compuestos 8, 20, 20l y 20m inhibieron la actividad rhNC, pero perdieron mucha potencia en lisados celulares, siendo inactivos en células intactas. Ningún compuesto inhibió la actividad AC. Los compuestos 20l y 20m fueron inhibidores de ACER3 en lisados celulares, así como en células intactas. Esta inhibición, medida por el ensayo de actividad de fluorescencia, se corroboró mediante análisis de los niveles de Cer por LC/MS. El segundo capítulo de la tesis se centra en el efecto de la Jaspina B (JB), un análogo cíclico de la So, como inductor de metuosis, un fenotipo de muerte celular caracterizado por la generación de vacuolas llenas de fluido que derivan de macropinosomas. La vía de señalización de Ras se ha visto implicada en algún caso de metuosis. El segundo objetivo de la tesis fue caracterizar los efectos celulares y la vía de señalización en la que está implicada la JB en la línea celular A549, que es mutante para K-RAS. Se comprobó que la JB inducía vacuolización en A549 y que la apoptosis, la autofagia o la necrosis no eran la causa de muerte celular. El tratamiento con JB provocó un aumento en la expresión de pAMPK y una disminución de pS6 y pAkt, posicionando la JB como inhibidora del eje PI3K/Akt/mTORC1, tanto en A549 como en la línea celular HGC27. No obstante, la implicación de esta vía en la muerte celular inducida por JB se descartó, ya que la inhibición de mTORC1, Akt o mTORC1/2 no indujeron vacuolización. En cambio, la fenformina, que activa AMPK, sí que indujo vacuolización proveniente de macropinocitosis, indicando que el aumento de expresión de pAMPK es crucial para el proceso de vacuolización inducido por JB.