Desarrollo de algoritmos diagnósticos en distrofias hereditarias de retina y su aplicación para la identificación de nuevas regiones candidatas

Resumen

Las distrofias hereditarias de retina (DHR) son un conjunto de enfermedades degenerativas caracterizadas por la afectación primaria de los fotorreceptores y las células del epitelio pigmentario de la retina, que suelen derivar en una ceguera legal. La elevada heterogeneidad clínica y genética de estas patologías complica su diagnóstico, por lo que es necesaria la implementación de herramientas diagnósticas de alto rendimiento. La secuenciación de nueva generación (NGS) es la técnica más usada actualmente para el diagnóstico molecular de enfermedades de base genética, debido a la capacidad de secuenciar de forma simultánea y rápida millones de fragmentos de ADN. Sin embargo, se estima que aproximadamente entre un 40-60% de los pacientes de DHR no reciben un diagnóstico genético tras estos análisis. Los objetivos de la presente tesis doctoral se centran en el aumento del rendimiento diagnóstico en pacientes afectos de DHR. Para ello, se han llevado a cabo distintos estudios en regiones no analizadas previamente en pacientes sin causa genética conocida tras la aplicación de un panel de genes de regiones exónicas. Así, de las 72 familias afectas de DHR que componen nuestra cohorte, 35 pacientes fueron estudiados mediante un panel de diseño propio de 68 genes para descartar causas genéticas en genes previamente asociados a DHR en población española. Por otra parte, se llevó a cabo el análisis de 29 pacientes mediante un panel de diseño propio de 79 genes, que contenía la secuencia completa de tres genes (ABCA4, CEP290 y USH2A) en los que se han descrito mutaciones intrónicas profundas como causa de enfermedad, para analizar la contribución de este tipo de mutaciones a la etiopatogenia de las DHR en nuestra cohorte, y permitir la detección de variantes estructurales y sus puntos de corte en el genoma. En pacientes sin diagnóstico genético tras los estudios mediante paneles se realizaron estudios de secuenciación mediante un exoma clínico comercial (12 pacientes) y un exoma completo (5 pacientes) para la identificación y evaluación de variantes en nuevos genes candidatos a causar DHR. Debido a que no existe una aproximación estándar para abordar el diagnóstico genético de los pacientes de DHR, se pretende establecer un flujo de trabajo eficiente que permita esclarecer cuál sería la primera aproximación diagnóstica (paneles pequeños de regiones exónicas, paneles grandes, exoma completo) y los sucesivos análisis en los casos no resueltos mediante la primera aproximación elegida. La definición de esta estrategia basada en secuenciación masiva se realizó mediante la aplicación de paneles de genes, un exoma clínico comercial y un exoma completo en pacientes de DHR, y la comparación de resultados. El empleo de las técnicas de NGS descritas anteriormente ha permitido el diagnóstico de 38 de las 72 familias que componen la cohorte de estudio, lo que resulta en una tasa de diagnóstico del 52,78%. De estas 72 familias, en 34 (47,2%) se encontró la causa de su enfermedad en genes asociados a DHR y previamente mutados en población española mediante el uso de paneles de un número reducido de genes (17 familias diagnosticadas mediante el panel de 68 genes y 17 mediante el panel de 79 genes). En cuatro familias, las mutaciones causantes de su enfermedad fueron detectadas mediante el estudio de exoma clínico comercial, estando tres de ellas localizadas en genes previamente asociados a DHR aunque no detectadas con anterioridad en población española, lo que nos ha permitido aumentar el espectro mutacional conocido en nuestra población. Gracias al diagnóstico genético de estas 38 familias se ha podido definir el modelo de herencia de la enfermedad en 13 casos aislados, mientras que en cuatro familias se ha realizado una reclasificación clínica a raíz de los resultados genéticos. Los estudios de prevalencia realizados han permitido concluir que el gen más mutado en nuestra población es USH2A, en el cual ha sido posible detectar dos CNV (una deleción y una duplicación) y sus puntos de corte gracias al uso del panel de 79 genes, en el que se incluía el gen USH2A completo. Tras el estudio mediante dicho panel, no se detectó ninguna mutación intrónica profunda que resultara ser la causa de la enfermedad, por lo que se concluye que estas variantes no parecen tener una contribución importante en la aparición de las DHR en nuestra población. De hecho, es necesaria una revisión de la causalidad de ciertas variantes consideradas tradicionalmente como patogénicas con el nuevo conocimiento generado mediante estudios de NGS, sobre todo, en genes polimórficos como ABCA4. Por último, el análisis de los datos derivados de los exomas ha permitido proponer tres nuevos genes candidatos a causar DHR en población española en tres familias. El uso de un algoritmo personalizado de análisis ha permitido incorporar tres nuevos pasos esenciales al flujo de trabajo, esto es; la eliminación de duplicados, que ha posibilitado la eliminación de falsas variantes positivas y negativas agilizando el proceso; la utilización de un archivo de diseño independiente de las sondas existentes, que permitió diagnosticar a una familia con mutaciones en un gen asociado a DHR que teóricamente no podía ser capturado con las sondas diseñadas; y un nuevo modelo de análisis de CNV usando datos derivados de NGS independiente del tipo de estudio, que ha permitido mejorar el filtrado y el análisis de los datos obtenidos por secuenciación masiva. Según los estudios realizados, el empleo de un panel de genes limitados se postula como primera aproximación para el diagnóstico genético de familias afectas de DHR, debido a su alta tasa diagnóstica, un menor coste por muestra secuenciada y mayores facilidades para la interpretación de los datos y su posterior almacenaje. En los casos de pacientes sin diagnóstico genético tras la aplicación de dicha estrategia, el estudio de exoma completo debe ser la segunda aproximación elegida, debido a la posibilidad de estudiar todo el exoma de un individuo con unas dificultades parecidas a otras estrategias con menor número de genes. El imparable desarrollo de la secuenciación masiva y la disminución progresiva de su coste permitirá en un futuro que las ventajas que aporta el genoma completo compensen su mayor coste con respecto a la secuenciación de exoma, esto es, la posibilidad de tener toda la información genómica de un individuo en un único archivo en lugar de estudiar al mismo paciente usando distintas aproximaciones.