Cryptic reservoirs of micro-eukaryotic parasites in ecologically relevant intertidal invertebrates from temperate coastal ecosystems unveiled by a combined histopathological, ultrastructural, and mole

Resumen

La mayoría de los eucariotas son organismos unicelulares (protistas), muchos de ellos pertenecientes a linajes que divergieron temprano en la historia evolutiva de este Dominio de organismos nucleados. Microscópicos, enormemente diversos y fenotípicamente convergentes, su clasificación cladística ha sido históricamente compleja, dejando atrás un extenso registro de taxones y de términos parafiléticos y polifiléticos. Teniendo que investigar atributos estructurales, celulares, biológicos y ecológicos en un mundo de rápidas interacciones y difícilmente accesible a simple vista, la protistología es particularmente dependiente de la sistemática. Ésta permite inferir rasgos de especies crípticas a partir de especies evolutivamente relacionadas.Las moléculas de ADN (y ARN), representan un "registro" preciso de estos eventos de diversificación, que preceden incluso a los más antiguos registros fósiles. En los últimos años, la maduración de los métodos de filogenia molecular, catalizados por una mayor accesibilidad a la secuenciación de próxima generación (NGS), está permitiendo resolver preguntas e hipótesis sobre la evolución y la especiación de estos organismos micro-eucariotas que no se habían podido responder mediante otros métodos. Por una parte, arboles filogenéticos construidos mediante concatenaciones de cientos, incluso miles de genes, están permitiendo rastrear la historia evolutiva de los linajes protistas hasta el último ancestro común de todos los eucariotas (LECA). Concomitantemente, análisis moleculares basados en genes e incluso fragmentos cortos (especialmente 18S rRNA), recuperados principalmente de matrices ambientales u orgánicas (eDNA o ADN ambiental), están revelando una ¿caja de Pandora¿ de diversidad micro-eucariota. Ésta diversidad ¿oculta¿ está transformando nuestra percepción de los protistas en la cadena trófica y la estructura ecológica. En el medio marino, sus papeles como autótrofos, heterótrofos (predadores, saprófitos, parásitos) o mixótrofos crece en importancia día a día. El aumento simultáneo de diversidad e importancia ha sido particularmente pronunciado entre los linajes de parásitos protistas, que adaptados a la vida dentro de un huésped son más inaccesibles y morfológicamente indistinguibles que sus homólogos de vida libre. Muy competitivo como estilo de vida, el parasitismo ha evolucionado de forma independiente varias veces en prácticamente todos los grupos eucariotas, en algunos incluso cientos de veces. De hecho, es posible que el efecto parapátrico que implica una existencia endosimbiótica, haya exacerbado la especiación entre los parásitos, que representan la que posiblemente sea la más común estrategia de consumo entre los organismos vivos. Es más, el número de especies crípticas que están, a día de hoy, siendo descubiertas en la mayoría de los linajes de parásitos protistas sigue aumentando abruptamente o apenas comienza a mostrar una desaceleración. Cabe destacar, que el descubrimiento de esta diversidad oculta, incluidas las especies crípticas, va más allá de la escalada en el número de especies; afecta los estudios sobre biología celular, ciclos biológicos, y ecología. Inexorablemente, esta fuerza mostrada por los métodos de análisis y secuenciación del ADN está abriendo una brecha entre la diversidad genética existente y nuestra comprensión de la morfología, patología, transmisión y posibles hospedadores de los parásitos protistas que la constituyen. Este desequilibrio es particularmente evidente entre los parásitos que infectan linajes de invertebrados, los cuales, salvo algunos taxones con interés comercial, permanecen en gran parte sin analizar, a pesar de constituir un grupo mucho más diverso que los vertebrados. Por una parte, es lógico que los parásitos protistas causantes de infecciones en especies marinas de interés comercial (peces, bivalvos, crustáceos¿) hayan sido priorizadas, pero hay que tener en cuenta que muchos de estos micro-eucariotas tienen ciclos de vida complejos, en los que pequeños invertebrados actúan muchas veces como vectores o reservorios. Descubrir y contextualizar estas asociaciones puede ser determinante a la hora de comprender cuándo y dónde puede variar la presión y capacidad infectiva de algunas de estas infecciones en la comunidad o huéspedes específicos. Al mismo tiempo que su diversidad e importancia aumenta, la inclusión progresiva de parásitos en modelos ecológicos está experimentando variaciones de gran alcance en la dinámica poblacional de las especies animales, vegetales o fúngicas en los ecosistemas. En consecuencia, las asociaciones entre parásitos y hospedadores se investigan cada vez más como una parte importante de la estructura de la comunidad, y no exclusivamente como una "molestia" para el ser humano y sus intereses. Por desgracia la inclusión de parásitos en modelos ecológicos está siendo lastrada por un profundo desconocimiento de estas interacciones. A diferencia de los organismos multicelulares, que han podido ser observados por científicos y aficionados durante siglos, la distribución espaciotemporal de la mayoría de los organismos unicelulares sigue siendo un profundo misterio. No obstante, dadas sus importantes funciones como vectores, huéspedes intermediarios y reservorios, una comprensión mucho más profunda del patobioma (patógenos asociados a un hospedador) y su variabilidad espacio-temporal es de suma importancia para un mayor poder de predicción de los factores de presión causantes de epidemias o zoonosis en el huésped, la población y el medioambiente.En este contexto, la hipótesis de este estudio plantea que especies de invertebrados comunes en la zona inter-mareal de ecosistemas costeros en climas templados son reservorios crípticos de un número significativo de parásitos micro-eucariotas (protistas) de interés para el medio y los recursos marinos. Eldescubrimiento progresivo de estas asociaciones ocultas de parásitos-huéspedes (mediante exámenes combinando técnicas histopatológicas, ultraestructurales y moleculares) permite una mejor comprensión de la morfología, patología, biología celular y ciclo de vida de dichos patógenos, lo que a su vez consiente un seguimiento más estrecho de los factores y presiones que promueven epidemias y zoonosis en una escala espacio-temporal. Para testar ésta hipótesis, un ecosistema-tipo (una localidad representativa de la costa sur de Reino Unido) fue analizado ecológicamente para determinar especies clave en el ecosistema. Entre las especies clave se identificaron cuatro grupos especialmente abundantes y presentes en otras localizaciones de las Islas Británicas durante todo el año, permitiendo la comparación y extrapolación de los resultados observados a otras localidades en Reino Unido y el Atlántico Noreste. Estos 4 grupos de invertebrados: Echinogammarus sp., Capitella sp., Procerodes sp., y copépodos harpacticoides de la familia Ameiridae, fueron histopatológicamente examinados durante distintas épocas del año, en busca de parásitos protistas. Los organismos que mostraron una mayor incidencia y diversidad de parásitos micro-eucariotas fueron los anfípodos. En consecuencia, Echinogammarus sp., y otros dos géneros de anfípodos comunes (Gammarus sp., Orchestia sp.) en el hábitat de esta localidad (Newton¿s Cove) fueron periódicamente examinados mediante histopatología, microscopía electrónica y técnicas moleculares. Posteriormente estos resultados se confrontaron a los obtenidos mediante el mismo procedimiento en otros tres ecosistemas costeros del suroeste de Inglaterra. Nuestras conclusiones son las siguientes: La población de anfípodos del genero Echinogammarus, representa un reservorio ecológicamente relevante pero no estudiado para un número considerable de micro-parásitos eucariotas, como lo demuestra el examen histopatológico de organismos dominantes en el macrobentos. Una gran diversidad de linajes protistas que infectan anfípodos, incluyendo Ciliophora, Apicomplexa, Microsporidia, Endomyxa, Syndiniales, Oomycetes y Filasterea fueron identificados en asociación a este y otros anfípodos. A diferencia de los parásitos ciliados, gregarinos y metazoos (nematodos, copépodos y digeneos), que a pesar de cierta variabilidad estacional aparecieron asociados a anfípodos durante todo el año; la incidencia de parásitos pertenecientes a los linajes Filasterea, Endomyxa, Microsporidia, Oomicetes y Sindiniales difirió sustancialmente según la especie hospedadora y la estación. En Echinogammarus sp. las poblaciones se caracterizaron por albergar infecciones abruptas y virulentas de protistas con alta incidencia, que siguen un patrón bastante predecible; Filasterea en mayo, Haplosporidia en junio y co-infecciones de Paramíxidas y Microsporidias a finales del verano. Las infecciones por estos mismos linajes protistas en Gammarus sp. y Orchestia sp., que forman agrupaciones más dispersas en la zona inter-mareal, tuvieron un progreso e incidencia más baja y constante. La comparación espacio-temporal de estas dinámicas de infección en lugares vecinos (sur de las Islas Británicas) mostró que las poblaciones de anfípodos que habitan en los estuarios están significativamente más parasitadas que las poblaciones costeras equivalentes; principalmente debido a una distribución estacional bi-modal (con dos picos) en el desarrollo de las infecciones. En términos generales, los análisis estadísticos muestran que Echinogammarus sp., sostiene una carga parasítica ligeramente mayor que Orchestia sp. A su vez ambos están significativamente más parasitados que Gammarus sp. Estas diferencias entre taxones se mantuvieron independientemente de la estación y la ubicación. La secuenciación del primer Syndinium sp. parásito de anfípodos proporcionó una nueva evidencia de estos crustáceos como hospedadores de un linaje de importantes parásitos de decápodos, que además comprende una gran diversidad oculta. La parasitación causada por los sindinidos, poco frecuente en las poblaciones de anfípodos estudiadas, se observó exclusivamente en Gammarus sp. La infección consistió en ¿fagos¿ parásitos que crecen y se reproducen en la hemolinfa del huésped hasta que causan congestión de los senos hemales y la muerte del hospedador. Este resultado sugiere que los anfípodos representan un reservorio desconocido de parásitos del Filo Sindiniales, que según análisis moleculares pararía de unas 50 especies conocidas de importantes patógenos de cangrejos, cigalas y langostas, a unas 9000 especies, aun por descubrir.Este estudio ha registrado por primera vez haplosporidios capaces de infectar anfípodos (Ascetosporea: Endomyxa: Rhizaria: TSAR Supergroup) en ecosistemas templados (Islas Británicas). En realidad, los análisis filogenéticos indican que estas infecciones son causadas por al menos dos especies nuevas y divergentes (a nivel evolutivo) entre sí. Haplosporidium echinogammari n. sp. y Haplosporidium orchestiae n. sp., que parasitan las poblaciones de Echinogammarus sp. y Orchestia sp., respectivamente. Se han secuenciado veinticinco nuevos genotipos distintos de haplosporas en asociacion a crustáceos. Prácticamente todos se agrupan en tres clados ¿ricos¿ en parásitos de crustáceos dentro del género Haplosporidium. Los análisis filogenéticos e histopatológicos llevados a cabo en una gran variedad de anfípodos, cangrejos, cigalas e isópodos recolectados en ecosistemas marinos y de agua dulce en Europa y América del Norte, indican que parte de la diversidad oculta dentro del linaje de los haplosporidios, tradicionalmente considerados parásitos de moluscos, tiene también crustáceos como hospedadores. Una nueva especies capaz de infectar anfípodos Txikispora philomaios (Txikisporidae; Filasterea; Opisthokonta), constituye el primer parásito confirmado dentro de la clase Filasterea, que junto con los coanoflagelados representan los parientes protistas más cercanos de los metazoos. El parásito, más pequeño ((2,3 -2,6 ¿m), que sus homólogos en la clase Filasterea y la mayoría de los holozoos, causa infección (a menudo intracelular) en la hemolinfa, tejido conectivo, tegumento, gónadas, hepatopáncreas y tejido nervioso de los géneros Echinogammarus y Orchestia. Los análisis ultraestructurales han demostrado la división celular dentro de los tejidos del huésped, el desarrollo de quistes y una probable estructura flagelar (corroborada por la presencia de genes que constituyen el kit de estructura genética flagelar). La posición de T. philomaios como la rama divergente más temprana dentro de Filasterea, se ha resuelto mediante análisis filogenéticos y filogenómicos; que muestra que los estudios filogenéticos de 18S que incluyen secuencias ambientales no caracterizadas pueden proporcionar información filogenética adicional capaz de ayudar en la determinación de relaciones evolutivas. Siguiendo este enfoque, al menos trece linajes previamente desconocidos de muestras ambientales se han incluido dentro de Filasterea, que hasta ahora estaba constituida por 5 especies. El estilo de vida parasitario de T. philomaios hace que el potencial como parásitos de algunos de estos linajes filastereos ocultos sea una hipótesis de trabajo realista. En base a los resultados obtenidos mediante este estudio, podemos establecer como tesis que, entre las especies de invertebrados comunes que habitan la zona inter-mareal en ecosistemas costeros de climas templados, los anfípodos representan un reservorio ecológicamente relevante pero no estudiado para un número significativo de parásitos micro-eucariotas, algunos de ellos de gran interés para el medio ambiente y los recursos marinos. La detección, identificación y caracterización (histopatológica, ultraestructural y filogenética) de estos parásitos y su asociación con anfípodos ha permitido contextualizar parte de la diversidad críptica existente, y revelar nuevas especies y linajes de parásitos. En paralelo, el cribado de huéspedes invertebrados dominantes (copépodos, poliquetos y platelmintos) en el hábitat de los anfípodos mediante enfoques microscópicos y moleculares ha revelado pistas para comprender las rutas de transmisión, los patrones estacionales de infección y la variabilidad natural de estos parásitos en ecosistemas costeros templados.