Caracterizacion y cultivo de celulas de la superficie ocular humana obtenidas mediante tecnicas no invasivas

Resumen

Objetivo. La presente tesis doctoral obtuvo, por métodos mínimamente invasivos, el número suficiente de células viables de la superficie ocular (específicamente de la conjuntiva o mucosa ocular) como para poder llevarlas a un cultivo in vitro durante al menos 5 días. El uso de métodos mínimamente invasivos y las técnicas de cultivo celular permitirá obtener un modelo in vitro para poder realizar ensayos de todo tipo (etiopatogénicos, terapéuticos, etc) e, incluso, poder lograr una monocapa que pueda usarse como trasplante para reconstruir la superficie ocular dañada (ceguera corneal). Hasta el momento, no existen publicaciones que demuestren haber conseguido este objetivo a nivel ocular, aunque si se ha realizado en otras mucosas. Metodología. Se ensayaron diversos métodos no invasivos (es decir, diferentes de la biopsia) de obtención de células, de manera que puedan realizarse sin molestias y, por ello, de manera repetida a lo largo del tiempo (por ejemplo antes y después de un determinado tratamiento) en un mismo paciente. Estos métodos son básicamente las citologías por impresión y por cepillado conjuntival. Se seleccionó la citología por cepillado porque permitió recuperar el mayor número de células con la mejor viabilidad posible. Posteriormente, se llevaron estas células a un cultivo in vitro, determinando el soporte celular (membrana amniótica desepitelizada), el medio de cultivo (DMEM/F12 con FBS 10%) y los aditivos más adecuados (EGF, hidrocortisona, toxina colérica e insulina) para estimular la supervivencia e, incluso, la proliferación celular. Como controles se utilizó la línea celular epitelial de conjuntiva humana sana (IOBA-NHC). Por último, se caracterizaron las poblaciones celulares obtenidas en suspensión mediante citometría de flujo para poder seleccionar las de interés para cada ensayo. También se caracterizaron por métodos convencionales (microscopía óptica, inmuno fluorescencia e inmuno histoquímica) las suspensiones celulares adheridas mediante citocentrifugación. Utilidad y futuras aplicaciones prevista del proyecto. Si se obtuviera un número y viabilidad suficiente de células que mantengan alguna capacidad proliferativa, se lograría tener un cultivo primario de células de la superficie ocular de la enfermedad que se desee. Aunque en principio de plantea como fuente inicial la conjuntiva, se podría pensar en un futuro, y valiéndose de esta experiencia previa, en la córnea y en el limbo. Esto permitiría realizar ensayos para avanzar nuestro conocimiento sobre la fisiopatología de una determinada enfermedad. Asimismo, se dispondría de un modelo muy adecuado para ensayar nuevos fármacos directamente sobre el epitelio enfermo. Y, por último, incluso se podrían utilizar monocapas de estas células para reconstruir superficie ocular dañada, pues existen evidencias de que las células madre epiteliales conjuntivales se encuentren en diversas localizaciones anatómicas de la superficie conjuntival.