Thermodynamic and structural analysis of ultrafast folding proteins

Resumen

En esta Tesis Doctoral se ha llevado a cabo un estudio termodinámico y estructural detallado de diferentes proteínas de plegamiento rápido con objeto de caracterizar su cooperatividad. Entre las técnicas empleadas para obtener información termodinámica se encuentran distintas espectrometrías en equilibrio como dicroísmo circular de ultravioleta lejano, fluorescencia, infrarrojos con transformada de Fourier, así como calorimetría diferencial de barrido. Las proteínas seleccionadas se espera que tengan un plegamiento rápido, con tiempos de microsegundos o inferiores. Hasta mediados de los años 90, las proteínas de plegado rápido habían quedado fuera de las técnicas instrumentales disponibles, hasta el gran avance en las técnicas capaces de trabajar en esas escalas de tiempo. Las proteínas de plegamiento rápido amplían el conocimiento del plegamiento proteico y cubren la brecha que separa los métodos experimentales y los computacionales, ya que tradicionalmente estos últimos tan solo han sido capaces de investigar procesos por debajo de la escala de milisegundos. La identificación experimental de los distintos escenarios de plegamiento predichos por la hipótesis de Bryngelson et al. [1] del paisaje de energía con forma de embudo que determina el plegamiento proteico es una tarea primordial. En 1999 V. Muñoz y W. A. Eaton [2,3] propusieron la selección de proteínas candidatas para la búsqueda de escenarios de plegamiento downhill frente al clásico mecanismo de dos estados. Las proteínas de plegado rápido con frecuencia presentan un plegamiento downhill ya que su pequeña o nula barrera energética acelera el plegamiento, y parece que pueden tener posibles funciones como interruptores o reóstatos moleculares [4-6], debido a que dependiendo de la conformación adoptada su función podría variar. Para esta Tesis nos centramos en proteínas candidatas a un posible plegamiento tipo downhill, ya que la pequeña barrera energética de estas proteínas permitiría el estudio de las poblaciones en lo alto de la barrera [7]. Por tanto, inicialmente se seleccionaron dos proteínas relativamente pequeñas con distinto contenido de estructura secundaria para estudiar los patrones de comportamiento relacionados con la estructura: un dominio WW (el tercer dominio WW de la ligasa de ubiquitina de ratón Nedd4-2), formado por láminas beta; y un dominio R3H (perteneciente al antígeno 7 asociado a esperma humano), tanto con láminas beta como con hélices alfa. Estos dominios muestran distinto comportamiento termodinámico que se relaciona, entre otras características, con su contenido de estructura secundaria, así como con las fuerzas hidrófobicas internas. En el dominio WW el estudio termodinámico ofrece características del plegamiento tipo downhill con su flexibilidad estructural típica en el estado plegado, y con un desplegado progresivo con dispersión de las temperaturas de transición entre ambos estados. Sin embargo, el dominio R3H presenta un plegamiento más cooperativo a pesar de una pérdida de estructura de las hélices alfa previo al desplegado. Además, otras dos proteínas interesantes desde el punto de vista de su plegamiento se han estudiado por distintas técnicas de Resonancia Magnética Nuclear (RMN), el dominio HP35 de la proteína Vilina, y la proteína gpW. El subdominio HP35 se ha usado con frecuencia en estudios de simulación molecular, y en él nos centramos en el desplegado de algunos de sus residuos seguido a nivel atómico por RMN, tomando como referencia el estudio “atom-by-atom” realizado por Sadqi et al.8 sobre el dominio downhill de un estado BBL (procedente de la unidad E2 de la enzima 2-oxoglutarato-deshidrogenasa de Escherichia coli). El subdominio HP35 mostró menos variación a la esperada de una proteína de plegamiento rápido con tendencia, en principio, hacia un escenario tipo downhill, convirtiéndola en la proteína más rápida con plegamiento de dos estados. Un estudio parecido se había llevado a cabo por Sborgi et al. [9] en la proteína gpW, para la cual el estudio atom-by-atom muestra el comportamiento de distintas sondas de RMN (15N y 1HN amídicos, 13Cα and 13Cβ), que puede ser complejo para procesos de plegamiento gradual como el caso de las proteínas tipo downhill [8] o más homogéneo para proteínas de dos estados [10] (a pesar de que pueden aparecer distintas tendencias a lo largo de rango de temperaturas). Por tanto, el desplegamiento térmico de la proteína gpW ha sido estudiada por técnicas termodinámicas [11], así como seguida a nivel atómico por RMN [9]. Sin embargo, su estado nativo puede ser una estructura no estática, ya que las proteínas cambian por alteraciones en su ambiente. Para ser capaces de profundizar en nuestro conocimiento del estado nativo de gpW hay que superar un obstáculo debido a la velocidad de plegado de esta proteína, muy rápida para las escalas de tiempo que abarca la Relajación Dispersiva (RD) por RMN. Esta técnica de RD por NMR permite detectar conformaciones metaestables en equilibrio con el estado nativo, que son casi imperceptibles por técnicas habituales, que normalmente promedian todas las estructuras, imposibilitando la distinción de estados poco poblados. Este detallado análisis ha permitido obtener información sobre la interconversión del estado nativo de la proteína con un estado “invisible”, poco poblado, que refleja la estructura no estática de la proteína. Este estado “invisible” tiene una estructura con las hélices alfa prácticamente intactas y la región de las hebras beta desestructuradas, incluso a bajas temperaturas, y aparece como un estado productivo intermedio al final del plegamiento. La región que se pierde su estructura al desplegarse puede contribuir a funciones de la proteína como interruptor conformacional (que se esperaría en una proteína con plegamiento downhill), anteriormente propuesto en otros sistemas con baja estabilidad en las láminas beta [12].