Advances in metabolomics strategies for the study of pulmonary and cardiovascular alterations

Resumen

La metabolómica como rama del conocimiento científico ha surgido muy recientemente y evolucionado con rapidez, hasta llegar a un conjunto básico de estrategias y metodologías suficientemente establecido. Sin embargo, no se puede considerar que se haya alcanzado un punto realmente satisfactorio en las metodologías a implantar, especialmente cuando se pretende llevar a cabo un estudio basado en la ¿huella metabólica¿ (metabolic fingerprinting). En la presente tesis se ha perseguido profundizar en la metodología, y desarrollar, poner a punto, implementar y aplicar metodologías de fingerprinting basadas en LC-MS y GC-MS para mejorar el conocimiento sobre alteraciones multifactoriales como algunas de las afecciones pulmonares y cardiovasculares. Para ello, se ha realizado una revisión bibliográfica exhaustiva (capítulo 1) para establecer los principios básicos acerca de las diferentes estrategias metabolómicas, y las sucesivas etapas de los flujos de trabajo. El objetivo de este capítulo es abordar todas las fases del experimento metabolómico, teniendo en cuenta los cuellos de botella de todo el proceso. Se ha estandarizado una nueva metodología para el tratamiento de datos y la identificación de los metabolitos que resulten significativos tras un análisis mediante fingerprinting con GC-MS (capítulo 2). Esta metodología se ha aplicado al estudio de una alteración multifactorial compleja como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Además de optimizar y estandarizar todos los pasos del tratamiento de muestra para la obtención de las señales adecuadas, se ha construido una nueva librería de datos para mejorar la calidad en la identificación de metabolitos. Los resultados han puesto de manifiesto las diferencias en la manifestación a nivel metabólico de la enfermedad entre hombres y mujeres, además de la posible implicación de los aminoácidos ramificados y otros compuestos del metabolismo intermediario en la patología. A partir del estudio de las huellas metabólicas obtenidas mediante LC-MS se abordó el problema de la identificación de metabolitos que pudieran actuar como biomarcadores que permitieran la estratificación de los pacientes afectados por el síndrome de apnea/hipopnea del sueño (capítulo 3). Se ha encontrado que las diferencias en algunos metabolitos lipídicos (PAF, lisofosfolípidos) y otros relacionados con la microflora intestinal (ácidos biliares, ácido pipecólico) están relacionados con la severidad de los síntomas. Entre las estrategias necesarias para poder encontrar compuestos que puedan servir actúen como biomarcadores, tras el establecimiento de las señales significativas en el estudio de la huella metabólica, hay que realizar estudios de elucidación estructural para poder llevar a cabo la identificación. Para buscar, confirmar e identificar biomarcardores de distress respiratorio en pacientes afectados por la gripe H1N1 se llevó a cabo el estudio de la huella metabólica y se pudo identificar hasta 65 metabolitos diferentes marcadores de distress (capítulo 4), relacionados con inflamación y la actividad de la microflora intestinal. Utilizando como estrategia inicial la metodología de huella metabólica, se llevó a cabo un perfilado funcional para obtener información acerca de las variaciones en ceramidas, y otros lípidos asociados, superando las dificultades relacionadas con el pequeño tamaño de muestra, y la concentración de los metabolitos de interés en la muestra (capítulo 5). Para llevar a cabo el estudio se trabajó además en el desarrollo de una herramienta informática que permitiera la búsqueda simultánea de información en las tres bases de datos más empleadas, además unificar los resultados. Al aplicar esta metodología al estudio de arterias de pollo sometidas a ciclos de normoxia/hipoxia se demostró el papel de la ceramida como mecanismo unificador de la respuesta a oxígeno. Además, se pudo estudiar el efecto sobre distintos lípidos del tratamiento con eplenerona en modelos in vitro e in vivo de miocardiopatía diabética. Por último (capítulo 6) se ha demostrado la viabilidad del enfoque metabolómico basado en la huella metabólica para estudiar posibles marcadores de aterosclerosis a nivel subclínico en un gran conjunto de muestras. Además de ser capaces de demostrar la robustez de la metodología, y su capacidad para detectar diferencias metabólicas incluso cuando las diferencias entre los grupos son muy pequeñas, se han podido encontrar diferencias en un conjunto de glicerolípidos, fosfolípidos y esfingolípidos.