Desarrollo de inmunobiosensores y sistemas de diagnóstico para aplicaciones biomédicasanálisis de la interacción ICAM-1/LFA-1 y detección de aspergilosis invasiva

Resumen

En la actualidad, el número de publicaciones científicas sobre biosensores es muy elevado, lo que refleja el gran interés que despierta este tema en la comunidad científica. El extraordinario atractivo de los biosensores radica en los numerosos campos en los que estos dispositivos encuentran aplicación como son la clínica y el cuidado de la salud. Por ello, en este trabajo, gracias a la prometedora aplicación de las proteínas de la familia de las inmunoglobulinas, se han desarrollado distintas estrategias para el cribado de fármacos con potencial para el tratamiento de metástasis, enfermedades autoinmunes e inflamación por medio de dispositivos de SPR y FRET, así como la detección de aspergilosis invasiva en pacientes inmunodeprimidos. La respuesta inflamatoria consiste en la liberación secuencial de mediadores y en el reclutamiento de leucocitos circulantes, los cuales se activan en el sitio de inflamación y liberan otros mediadores. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la respuesta inflamatoria se elimina por la liberación de mediadores antiinflamatorios endógenos (citoquinas antiinflamatorias), así como por acumulación de factores reguladores negativos intracelulares. Por lo tanto, las células inflamatorias dejan de actuar en el momento oportuno. Sin embargo, la acumulación persistente y activación de los leucocitos son un sello de la inflamación crónica, lo que sugiere una disfunción de estos mecanismos reguladores negativos. Durante mucho tiempo, el enfoque clínico para el tratamiento de la inflamación se centraba principalmente en la inhibición de la producción de mediadores pro-inflamatorios y en la supresión de la iniciación de la respuesta inflamatoria, es decir, la supresión de las vías de señalización positivas de citoquinas proinflamatorias. Sin embargo, estos medicamentos, aunque pueden disminuir la inflamación y mejorar los síntomas, no proporcionan una cura o previenen futuros brotes de la enfermedad. Por ello, dada la importante contribución de la acumulación persistente de linfocitos en el sitio de inflamación, la interacción ICAM-1/LFA-1 ha ganado considerable atención como una diana molecular para la atenuación de las respuestas inmunes hiperactivas y enfermedades inflamatorias. Publicaciones recientes han informado de resultados positivos en ensayos humanos de enfermedad inflamatoria y autoinmunes. La diseminación metastásica de tumores sólidos es la complicación más fatal en las enfermedades malignas y la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer. Esto es de gran relevancia para tumores altamente proliferativos con una agresiva tendencia a metastatizar como el melanoma. La mayoría de las células tienden a metastatizar principalmente a través del torrente sanguíneo a diferentes órganos. Los mecanismos moleculares de los procesos metastásicos son complejos y no están completamente dilucidados. Aunque los agentes citostáticos o fármacos antiangiogénicos (por ejemplo, bevacizumab) afectan al crecimiento del tumor primario y al desarrollo de la metástasis, a día de hoy no existe una estrategia general antimetastásica en la clínica para interferir la diseminación tumoral. Los receptores de adhesión están fuertemente involucrados en el proceso de la metástasis de células tumorales, ya sea por la desregulación de las funciones adhesivas y, posteriormente, el desprendimiento de células tumorales desde el tumor primario y la superación de las fronteras de tejidos, o por mediación de contactos de células con componentes de la sangre en la fase de distribución hematógena. Una de las moléculas de adhesión más importantes durante este proceso es ICAM-1. Esta proteína, sobreexpresada en células metastásicas, es considerada como un jugador clave en la formación de contactos de las células tumorales con las plaquetas y los leucocitos, facilitando así la formación de agregados y aceleración de la diseminación metastásica. Dada la importancia de estas enfermedades y a la falta de tratamiento para inhibir la diseminación tumoral, se llevó a cabo el desarrollo de dos biosensores para la detección de fármacos que pudieran tener un potencial beneficioso para inhibir la extravasación de las células tumorales y los linfocitos. El primer biosensor desarrollado esta basado en la interacción de la proteína recombinante de ICAM-1 marcada con un fluoróforo y un péptido de CD11a de alta afinidad (CD11a237-261) marcado con otro fluoróforo. Al estar en contacto, se produce FRET mientras que cuando se bloquea esta interacción, FRET desaparece. El segundo biosensor, basado en el mismo principio de interacción ICAM-1/LFA-1 pero en un dispositivo de SPR, también fue capaz de detectar el bloqueo de esta interacción. Además, esta técnica no se ve influenciada por el pH como puede ocurrir en el biosensor de FRET al afectar a la fluorescencia de los fluoróforos (efecto quenching). Dado que la interacción ICAM-1/LFA-1 es importante durante la extravasación de las células metastásicas, un fármaco que pudiera romper esta interacción en nuestros biosensores podría resultar muy útil para evitar este proceso tumoral in vivo. Estas dos técnicas fueron especialmente elegidas dado su historial como uso de biosensores. Por medio de los biosensores desarrollados en este trabajo, se demostró que el péptido de alta afinidad CD11a237-261 era capaz de romper la señal de los biosensores, dando a entender que podría tratase de un potencial fármaco a probar. No obstante, dado que esta clase de inhibidores bloquea la interacción ICAM-1/LFA-1, es importante elegir un modelo experimental que presente una reactividad cruzada con la humana para poder extrapolar fielmente los resultados obtenidos y poder llevarlo a ensayos clínicos. Dado que parecía existir una reactividad cruzada con la especie de ratón para la interacción ICAM-1/LFA-1, se llevaron a cabo varios experimentos in vitro con células de ratón. Los resultaros obtenidos en este trabajo mostraron que existía una completa reactividad cruzada entre ambas especies y que el péptido CD11a237-261 era capaz de bloquear actividades celulares mediadas por ICAM-1/LFA-1. Además, incluso la proteína de ICAM-1 sintetizada D1D2 es capaz de interferir de manera eficiente la interacción ICAM-1/LFA-1 en este modelo. A falta de realizar ensayos in vivo, este tipo de fármaco podría resultar beneficioso para el tratamiento de la metástasis e incluso de enfermedades autoinmunes e inflamatorias, ya que la interacción ICAM-1/LFA-1 también media la extravasación de linfocitos a los tejidos. Hasta hace poco tiempo el diagnóstico de enfermedades infecciosas consistía básicamente en el cultivo microbiológico y pruebas químicas, métodos en general largos y tediosos que requieren mucha mano de obra y son difíciles de automatizar. La biotecnología moderna aporta nuevas herramientas diagnósticas que son especialmente útiles cuando los microorganismos causantes de las enfermedades son difíciles de cultivar, ya que permiten su identificación sin necesidad de aislarlos. La aspergilosis invasora es una causa importante de morbilidad y mortalidad en enfermos inmunocomprometidos. El diagnóstico se hace frecuentemente de forma tardía e incluso post-mortem, estimándose actualmente que hasta un 30% de casos de aspergilosis invasiva no se diagnostica ni trata, siendo un hallazgo necrópsico. El diagnóstico temprano es esencial para poder instaurar un tratamiento antifúngico que conduzca al éxito. Así por ejemplo, en un estudio realizado con enfermos hematológicos neutropénicos, la mortalidad atribuida a la aspergilosis fue del 90% cuando la infección fue diagnosticada y tratada más de 10 días después de la aparición del primer signo clínico y/o radiológico, descendiendo al 40% cuando el tratamiento fue instaurado precozmente. No obstante, también existe el problema de que los tratamientos son muy tóxicos, por lo que el diagnóstico debe ser muy preciso. Todo ello hace que se tenga que trabajar en dos direcciones: desarrollar métodos diagnósticos más precoces y selectivos y disponer de medicamentos menos tóxicos y con menores riesgos que permitan iniciar la profilaxis. Las técnicas microbiológicas tradicionales (visión directa y cultivo de esputo) tienen una baja sensibilidad (15-20%). El lavado broncoalveolar y las biopsias de tejidos pueden mejorar los resultados, pero al tratarse de procedimientos invasivos, raramente pueden ser realizados en este tipo de pacientes debido a la gravedad de su estado y/o trombopenia. Las técnicas radiológicas complementan el diagnóstico, aunque no siempre se detecten lesiones nodulares en la radiología y sólo es fiable el signo del halo visualizado en la tomografía axial computarizada. Por esta razón, se llevó a cabo el desarrollo de un nuevo método de diagnóstico para la temprana detección de una infección provocada por A. fumigatus. Para ello, en este trabajo se ha desarrollado un ELISA capaz de detectar la micotoxina bis(metil)gliotoxina, la cual es liberada durante las primeras etapas de la infección. A falta de realizar estudios poblacionales más grandes y con diferentes clases de pacientes para asegurar la fiabilidad del método, este sistema es capaz de discriminar entre personas sanas y pacientes que clínicamente ya habían sido diagnosticados con una infección de A. fumigatus. Sin embargo, en un futuro próximo, esta técnica podría utilizarse en centros hospitalarios para el diagnóstico de aspergilosis invasiva junto con la detección de galactomanano y el resto de pruebas clínicas. En esta tesis doctoral hemos llevado a cabo dos líneas de trabajo, ambas encaminadas al desarrollo de sistemas de detección: el primero, para potenciales fármacos para el tratamiento de diversas enfermedades como la metástasis, la inflamación y enfermedades autoinmunes. El segundo, para la detección temprana de la presencia de Aspergillus fumigatus en personas susceptibles de sufrir dicha infección. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en este trabajo, podemos obtener las siguientes conclusiones generales: 1- Desarrollo de un biosensor de fluorescencia para la detección de posibles fármacos para el tratamiento de metástasis, inflamación y enfermedades autoinmunes. El protocolo de purificación y plegamiento en columna a partir del modelo de expresión procariota permite obtener proteínas recombinantes de ICAM-1 puras y con gran bioactividad. Sin embargo, la proteína D1D2Fc presenta cierta degradación. A partir del modelo de expresión eucariota Pichia pastoris, no fue posible sobreexpresar ICAM-1 recombinante humano con el plásmido pPICZ¿-D1D2Fc. Por medio del modelo de expresión eucariota HEK293T, fue posible llegar a producir las proteínas recombinantes de ICAM-1, D1D2 y D1D2Fc. Sin embargo, no se consiguió purificar D1D2 pero si D1D2Fc si bien presentaba una contaminación con albúmina Las técnicas espectroscópicas de dicroísmo circular y fluorescencia intrínseca de triptófanos demostraron que las proteínas de ICAM-1 producidas en el modelo procariota estaban bien plegadas y los dominios 1 y 2 de inmunoglobulina de D1D2Fc poseen una estructura de láminas ß. Los estudios de RMN mostraron problemas de agregación de la proteína D1D2, lo que impidió el estudio de la interacción con los péptidos de interés a pesar de haber logrado un elevado grado de marcaje con 15N. D1D2Fc es capaz de unirse a péptidos procedentes de LFA-1 con alta afinidad. D1D2Fc es capaz de reconocer a LFA-1 presente en células T y de mediar la adhesión de células B activadas. Las proteínas recombinantes de ICAM-1 y péptidos de LFA-1 son capaces de bloquear la actividad citotóxica de células NK humanas. Las proteínas de ICAM-1 son capaces de bloquear la adhesión de monocitos y macrófagos humanos. Por medio de la interacción entre la proteína D1D2Fc conjugada con FITC y del péptido de alta afinidad CD11a237-261 conjugado con TMRE, hemos podido observar transferencia de energía entre ambos fluoróforos. Esto denota que este sistema podría utilizarse como un sensor en la búsqueda de fármacos para el tratamiento de patologías donde la interacción ICAM-1/LFA-1 este implicada. El péptido CD11a237-261 es capaz de inhibir la transferencia de energía de resonancia de Föster en el biosensor actuando como un posible fármaco para el tratamiento de patologías mediadas por la interacción LFA-1/ICAM-1. La afinidad de la interacción de ICAM-1/LFA-1 aumenta conforme disminuye el pH. Los péptidos de LFA-1 y las proteínas de ICAM-1 son capaces de inhibir la agregación homotípica de células B humanas mediada por ICAM-1/LFA-1 tanto a pH 7,2 como a 6,5. Las proteínas recombinantes humanas de ICAM-1 y péptidos humanos de CD11a son capaces de interaccionar con LFA-1 e ICAM-1 de ratón respectivamente mostrando reactividad cruzada entre ambas especies. 2- Desarrollo de un sistema de detección temprano de Aspergillus fumigatus en pacientes inmunocomprometidos mediante ELISA. La inmunización de ratones con el conjugado albúmina-bmGT generó anticuerpos específicos para bmGT. Gracias a la utilización de una solución de sucrosa como conservante de las placas ELISA, se consiguió mantener la estabilidad del método durante 7 semanas. La sensibilidad del método ELISA fue de 16 pg. A través de la detección de bmGT por ELISA, es posible discriminar entre pacientes sanos y pacientes infectados por Aspergillus fumigatus. Hemos desarrollado un test ELISA para la detección de bmGT como marcador de diagnóstico de IA.