Caracterización de la población microbiana del ciego de conejos en función del tipo y nivel de fibra en la dieta

Resumen

Las actividades experimentales realizadas en esta Tesis se encuadran en los objetivos generales de caracterizar la microbiota del ciego de conejos en función del nivel y tipo de fibra en la dieta y en base a lo expuesto, se plantearon algunos objetivos que nos permitieran evaluar la biodiversidad microbiana del ciego de conejos en crecimiento, en conejas en lactación y sus camadas en función del contenido de fibra en la dieta materna, centrándose en la fracción soluble (FSND) e insoluble (FND) y en la relación FSND/FND. El conocimiento de las necesidades nutritivas de esta especie y del efecto que la fibra pueda causar nos permitiría diseñar el sistema de alimentación más conveniente así como la formulación de las dietas más adecuadas para garantizar su salud intestinal y productividad. Para lograr los objetivos de esta Tesis se han desarrollado 3 experimentos que se detallan a continuación: En el primer experimento se formularon cuatro dietas experimentales en una estructura factorial 2x2, con dos niveles de fibra insoluble (FND) (BI=370 y AI=450 g/kg MS) y dos de fibra soluble (FSND) (BS=150 y AS=180 g/kg MS) en sustitución del almidón. Para ello se utilizaron 24 conejos de raza Neozelandesa destetados a 28 días con 630±80,2 g de peso (6 conejos/dieta). Los conejos fueron alojados en jaulas según el tratamiento y alimentados ad libitum durante 14 días. Entre los 42 y 49 días de edad se pasaron a jaulas metabólicas individuales para determinar la digestibilidad in vivo de la materia seca (DvMS), materia orgánica (DvMO) y fibra neutro detergente (DvFND). También se recogió orina para la determinación de derivados púricos (DP). Una vez finalizado el balance, a los conejos se les colocaron collares cervicales durante 24 horas para la recogida de cecotrofos (CT). Se dejaron 24 horas adicionales con su respectiva dieta para recuperación del ambiente cecal, se sacrificaron y se les extrajo el ciego. Inmediatamente se midió el pH del contenido cecal (CC) y se muestreó para determinar la concentración de amoniaco (NH3) y ácidos grasos volátiles (AGV), y evaluación de la microbiota cecal. El resto del CC se utilizó como inoculo para el estudio de degradabilidad cecal in vitro de la MS (dcMS) y producción de gas durante 18 horas. Como sustrato a fermentar se emplearon las dietas experimentales previamente digeridas con HCl-pepsina y pancreatina, simulando la digestibilidad prececal de los conejos. Al CC y CT se les extrajo el ADN y se le determinó diversidad de bacterias y arqueas metanogénicas mediante electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE). La concentración de bacterias y arqueas metanogénicas, y la abundancia relativa de Ruminococcus albus, R. flavefaciens, Fibrobacter succinogenes, Butyrivibrio fibrisolvens y Prevotella ruminicola fueron cuantificadas mediante PCR a tiempo real (qPCR). La DvMS disminuyó con la FND desde 51,8 hasta 44,2% (P<0,001), pero no fue afectada por el nivel de FSND (P>0,10). Por el contrario, la DvFND y la dcMS solo respondieron a la FSND incrementando desde 15,6 hasta 20,0% y 14,1 hasta 20,5%, respectivamente (P<0,01). El CC incrementó con la FND (P<0,001) y FSND (P<0,01). La producción de CT aumentó con la FND desde 20,1 hasta 25,5 g MS/d (P<0,05), mientras que su proporción de proteína bruta (PB) se redujo con la FND (P<0,001) y aumentó con la FSND (P<0,01). La concentración de NH3 fue mayor con la dieta AIAS (90,1 mg/l) y menor en AIBS (70,4 mg/l) (interacción, P<0,05). El pH y proporción de AGV no respondieron a los tratamientos, sin embargo, los AGV totales tendieron a disminuir con la FND (P=0,095). Las dietas AS presentaron mayor producción de gas (P<0,001) hasta las 18 h de incubación, mientras que en dietas AI se redujo (P<0,01). Los DP totales fueron más bajos en la dieta AIAS (interacción, P<0,05) (Artículos I y IV). El DGGE reveló cambios en la población de bacterias y arqueas metanogénicas. La comunidad arquea disminuyó su concentración e índices de biodiversidad (Shannon y riqueza) con la dieta AS (P<0,01). La cantidad de bacterias totales tendió a incrementar (interacción, P=0,075) con la fibra soluble, pero solo con el nivel más bajo de FDN. Las especies R. albus y F. succinogenes no fueron afectados por los tratamientos (P>0,05). La proporción relativa de B. fibrisolvens fue mayor en la dieta con el nivel más bajo de ambos tipos de fibra (interacción, P=0,055). No se logró detectar R. flavefaciens y P. ruminicola. Se concluye que el nivel y tipo de fibra son factores importantes que promueven cambios en el ecosistema cecal de los conejos, ya que se observaron cambios en la estructura de las comunidades microbianas provocados por la FSND, en particular de arqueas metanogénicas (Artículo IV). La estructura de la población bacteriana y biodiversidad de los CT fue muy parecida a la del CC (Artículo III). En el experimento 2 se compararon dos formas de alimentación diferentes según el origen de los conejos. Se utilizaron 16 conejos silvestres (CS) que vivían libres en la localidad de Magallón, Zaragoza-España, y fueron contrastados con dos grupos (n=4) de conejos de producción (CP) alojados en jaulas y ambiente controlado (18-24ºC, 08:00-20:00 h luz) recibiendo dos dietas (145 g PB/kg MS y 370 g FND/kg MS) con dos niveles de FSND, bajo (BS: 148 g/kg MS) o alto (AS: 186 g/kg MS) desde el destete (28 días) hasta los 51 días de edad, momento en el cual fueron sacrificados. A los conejos se les extrajo el ciego y se midió el pH del contenido cecal (CC) y se muestreó para determinar de NH3, AGV y estudiar la microbiota cecal. Se extrajo el ADN del CC y se determinó la biodiversidad de bacterias y arquea metanogénicas mediante DGGE, y se cuantificaron por qPCR. Los CS presentaron menor pH (5,69 vs 6,14; P<0,05) y NH3 (52,7 vs 80,6 mg/l; P<0,05), y mayor concentración de AGV (119,4 vs 85,8 mM; P<0,05) que los CP. Sin embargo, menor proporción de acetato (0,763 vs 0,839 mM; P<0,001) y mayor de butirato (0,180 vs 0,107 mM; P<0,001) que los CP. El DGGE reveló claras diferencias entre las poblaciones de bacterias y arquea de animales de distinto origen. Los CS presentaron menor abundancia de bacterias (15,719 vs 48,804 ng DNA/mg de contenido fresco) y arquea (2,923 vs 13,459 ng DNA/mg de contenido fresco), y similitud entre comunidades bacterianas (23 vs 52%). Sin embargo, la similitud entre comunidades de arquea fue ligeramente mayor (40 vs 35%). Aunque la biodiversidad de arqueas en CS fue menor a los CP con dieta BS (2,332 vs 3,071) fue similar a los del tratamiento AS (2,397). En conclusión, las características de fermentación son diferentes en ambas especies animales, posiblemente por albergar poblaciones de microbianas diferentes. Sin embargo, la comunidad de arquea de CS es muy parecida a los de los CP con dietas altas en fibra soluble, lo cual puede indicar su alta capacidad de selección. De este experimento se generaron tres comunicaciones a congresos internacionales y dos artículos que fueron publicados en revistas indexadas. El experimento 3 se realizó en una granja con historial de enteropatía epizoótica del conejo (EEC) y se evaluó el posible impacto de la dieta sobre la microbiota cecal de conejas en lactación y sus gazapos. Para ello se formularon dos dietas experimentales con dos relaciones de FSND/FND (baja: BR: 140/475 y alta: AR: 188/433). Se utilizaron ocho conejas y sus camadas (n=4), y las dietas se suministraron de forma conjunta desde el día 17 de lactación hasta el destete (28 días). Después los gazapos continuaron recibiendo las dietas experimentales hasta los 49 días de edad, mientras que las conejas pasaron a consumir una dieta comercial para reproductoras. En las conejas los CT se recogieron a los 17 y 28 días de lactación, y en los gazapos a los 17 días (sacrificando 2 gazapos/camada para recoger el CC), 28 y 49 días de edad. Se usó DGGE para el estudio de la biodiversidad cecal y qPCR para cuantificar bacterias totales y abundancia relativa de R. albus, y B. fibrisolvens. Se detectó un total de 66 y 67 bandas en DGGE de las conejas a los 17 y 28 días de lactación y 100, 71 y 89 bandas para los gazapos a los 17, 28 y 49 días, respectivamente. En conejas, la biodiversidad incrementó desde 3,49 a 3,71 con los días (P<0,01), y aunque la concentración de bacterias totales permaneció igual, la abundancia relativa de B. fibrisolvens disminuyó a los 28 días, mientras que R. albus solo disminuyó con los días de lactación cuando las conejas consumían dietas AR (interacción, P<0,05). En gazapos, la biodiversidad incrementó a los 28 días (3,60 a 3,71) y luego disminuyó a 3,57 (P<0,05) a los 49 días de edad. La concentración de bacterias totales y la abundancia relativa de R. albus y B. fibrisolvens aumentaron con la edad (P<0,001), básicamente por el consumo de pienso. La microbiota cecal de las madres ejerció una marcada influencia sobre la de los gazapos, manifestándose en una alta homogeneidad mientras consumían solo leche (17 días) o leche más pienso (28 días), sobre con dieta AR. En conclusión, la ingesta de dieta sólida es el factor más determinante en la maduración del ecosistema cecal de los conejos.