Disfunción trofoblástica secundaria a la infección por el virus del papiloma humano y asociación con el parto pretérmino

Resumen

1) Introducción 1.1. Impacto clínico del parto pretérmino. La prematuridad (nacimiento que se produce entre la viabilidad fetal y las 37 semanas) continúa siendo el principal problema al que se enfrentan la obstetricia y la neonatología. Se considera la causa de cerca del 70% de la morbi-mortalidad neonatal. (1) En nuestro medio, alrededor del 7-10% de las gestaciones finalizan antes del término, lo que supone una incidencia anual en España de 35000 a 50000 casos/año. Todo ello implica un coste sanitario y social muy elevado. Aunque el mayor coste por prematuridad se concentra en los prematuros extremos, el coste de los prematuros moderados (entre 34 y 36 semanas) no es despreciable considerando que constituyen un número mucho mayor. (2) La amenaza de parto pretérmino (definida como la aparición de dinámica uterina y modificaciones cervicales antes de las 37 semanas) constituye la primera causa de ingreso durante la gestación (3) excluyendo el trabajo de parto a término. Aunque la mayoría de estas pacientes (70-80%) no presentarán finalmente un parto prematuro, la incidencia de prematuridad en este grupo de pacientes es de un 20-30% (4), estando duplicado o triplicado respecto a la población general y constituyendo un grupo de riesgo con demostrado peor resultado perinatal.(5) 1.2. Etiopatogenia de la infección en el parto pretérmino. Hasta en un 31-40% de los casos, la etiología del parto pretérmino es desconocida. De las causas conocidas, la más frecuente es el síndrome de respuesta inflamatoria secundario a la infección gestacional, responsable en un 10-12% de los casos del parto prematuro espontáneo con bolsa íntegra y hasta en un 30-50% de los casos secundarios a rotura prematura de membranas (6,7) Las toxinas producidas por los microorganismos que infectan el tracto genital inferior activan, a nivel de las membranas fetales, la decidua y el amnios, la producción de citoquinas. En una fase inicial, las toxinas producidas por estos microorganismos alcanzan vía ascendente la decidua y activan, a nivel de ésta y las membranas fetales, una respuesta inflamatoria local a través del reclutamiento de leucocitos, que se traduce en la producción de citoquinas proinflamatorias (IL1, IL2, IL6, IL18, IL8, IFN, TNF) y mediadores inflamatorios (metalloproteinasa-8 (MMP-8), factores de activación plaquetaria, prostaglandinas, leucotrienos, óxido nítrico, etc.). Estos factores inflamatorios estimulan la producción de prostaglandinas en el amnios, corion, decidua y miometrio que permiten la contractibilidad uterina, la dilatación cervical y la exposición de las membranas a la entrada de microbios en la cavidad uterina. En los espacios extrauterinos, las prostaglandinas regulan la liberación de citoquinas inflamatorias que actúan de forma sinérgica con la IL8, aumentando la quimiotaxis de los neutrófilos y estimulando la liberación de metaloproteinasas (MMP). Las MMP están implicadas en los procesos de borramiento cervical y en la degradación de las membranas fetales. Degradan el tejido conectivo permitiendo la ruptura de las membranas e induciendo el parto pretérmino (8,9). Parece por lo tanto, que las alteraciones del desarrollo trofoblástico pueden ser una de los desencadenantes del parto pretérmino, como demuestran recientes estudios anatomopatológicos (10) y hormonales (11). La mortalidad neonatal relacionada directamente con la infección de los productos de la gestación es superior al 10% en estos prematuros (12). La infección es causa no sólo de parto pretérmino, sino también de rotura prematura de membranas, corioamnionitis clínica e histológica, funisitis, puntuaciones inferiores en el test de Apgar, mayor porcentaje de admisión en Unidades de Cuidados Intensivos Neonatales, distrés respiratorio neonatal, neumonía, sepsis, hemorragia intraventricular, displasia broncopulmonar, bajo peso al nacimiento y morbilidad a largo plazo, como la parálisis cerebral, diversas alteraciones cognitivas y la enfermedad crónica pulmonar (13,14). 1.3. Impacto clínico de la infección por virus del papiloma humano. El virus del papiloma humano (VPH) pertenece a la familia de Papillomaviridae. Gracias al uso de la secuenciación del ADN, hasta la fecha se han identificado, aproximadamente, 200 tipos de virus del papiloma humano (VPH). Cada tipo muestra un tropismo particular por sitios anatómicos específicos, siendo comunes las infecciones de piel y mucosas del tracto oral y respiratorio. Los papilomavirus humanos, aprovechan la maquinaria celular para replicarse; son epiteliotrópos y su ADN puede permanecer en forma episomal, en estado latente, o bien abandonar esa latencia y aprovechar la diferenciación celular propia del epitelio cervical. Se establece un periodo de incubación de 6 semanas a 2 años para que se manifiesten las lesiones clínicas o subclínicas de la infección. La infección por VPH se puede expresar en forma clínica, subclínica o latente (15). Aproximadamente 40 de estos tipos de VPH infectan el epitelio del tracto genital. Los tipos anogenitales de VPH, virus de transmisión sexual, se han dividido en dos clases mediante estudios epidemiológicos dependiendo de su asociación con el cáncer de cuello de útero (16): - Tipos de bajo riesgo oncogénico: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 y 89. - Tipos de alto riesgo oncogénico: 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 y 82. Se estima que 630 millones de personas están infectadas con el VPH en todo el mundo. Al menos la mitad de los hombres y mujeres sexualmente activos adquieren una infección por el VPH en algún momento de su vida. La infección por el VPH es más común en los jóvenes con edades entre los 18 y 28 años. La expresión clínica más conocida de la infección por VPH la constituyen los condilomas acuminados o verrugas genitales, asociados aproximadamente un 90% a infecciones por los VPH 6 y 11. Se asume que la infección por el virus del papiloma humano es condición necesaria, pero no suficiente, para el desarrollo de cáncer de cérvix uterino. Los VPH 16 y 18 causan el 70% de todos los tipos de cáncer cervical. Recientemente se han comercializado vacunas contra la infección por serotipos de VPH 16 y 18 (17). Campañas poblacionales de vacunación se han iniciado en varios países con el ánimo de disminuir la prevalencia del càncer de cervix, si bien existen controversias sobre su efectividad a largo plazo y su eficiencia coste-beneficio (18). 1.4. Virus del papiloma humano y gestación. La prevalencia de infección por HPV en mujeres embarazadas oscila del 5,4% al 68,8%, con mayor riesgo en menores de 26 años, decreciendo su prevalencia conforme aumenta la edad materna. La carga viral aumenta durante la gestación y disminuye en el post parto. Estudios de prevalencia en embarazadas con infección genital asintomática muestran que los serotipos 16 y 18 son los más frecuentes en secreción cervical y sangre venosa materna. La prevalencia de infección por VPH 16/18 entre las mujeres embarazadas es del 22,6%. Las tasas de prevalencia de infección por VPH de alto riesgo aumentan durante la gestación alcanzado máximos en el tercer trimestre. Sin embargo la prevalencia de VPH de bajo riesgo no parece aumentar durante la gestación. Se ha demostrado infección por VPH en sangre de cordón, líquido amniótico y trofoblasto, por lo que parece claro que existe una diseminación ascendente desde el aparato genital inferior (19-20). Uno de los tratamientos de las lesiones intraepiteliales de alto grado (H-SIL) producidas por la infección por VPH es la conización cervical. La disminución de la longitud cervical tras la conización ha sido descrita como una causa de incontinecia cervical, asociada con un incremento de la presentación de parto prematuro. Sin embargo, existe escasa evidencia sobre el potencial papel patogénico en el parto pretérmino de la infección genital por VPH. 1.5. Disfunción troboblástica secundaria a la infección por VPH. La detección ectocervical de ADN de tipos de VPH de alto riesgo oncogénico se ha correlacionado con la presencia de ADN de los mismos tipos en células trofoblásticas en un 25% de las ocasiones. La detección de VPH en tejido trofoblástico es mayor en los abortos espontáneos que en los abortos electivos (21). Un estudio reciente han demostrado un incremento significatico de placentas infectadas por VPH en partos pretérmino respecto placentas de partos a término (50% vs 20%), siendo los tipos 16 y 18 los más frecuentemente encotrados en las placentas de los partos pretérmino (22). Los genomas de 4 diferentes tipos de VPH han sido seleccionados para reproducir los ciclos vitales completos en una variedad de células trofoblásticas (3ª trophoblasts) y los datos demuestran que pueden llevar a cabo su ciclo replicativo completo y que disminuyen el número de células trofoblásticas y la adhesión celular en un sistema in Vitro (23). Además, otros autores han descrito que los oncogenes E6-E7 del tipo VPH 16 produce in vitro una discrupción del desarrollo trofoblástico (24). 1.6. Estudio de la disrupción/disfunción trofoblástica secundaria a la infección por VPH. La IL6 es probablemente la citoquina más relacionada con la fisiopatología del parto pretérmino asociado a la infección. La IL6 ha demostrado ser el marcador predictivo más sensible de infección intraamniótica en la amenaza de parto pretérmino y membranas íntegras, con porcentajes que oscilan del 80 al 100%, según las series. El estudio de placentas de niños prematuros muestra una mayor expresión de receptores para la IL6. Se ha descrito una correlación entre los niveles de IL6 en sangre de cordón y la respuesta inflamatoria placentaria demostrada por estudios anatomopatológicos (24). El TNF alpha ha sido descrito como un marcador sensible de disfunción placentaria determinado tanto sangre de cordón umbilical como en trofoblasto (26,27). Por otra parte, el IFN gamma es una de las citoquinas más relacionadas con la infección por VPH, y ha sido ampliamente estudiada como factor pronóstico oncogénico para el carcinoma de cérvix uterino.(28) 1.7. Justificación. Hasta el momento, no existen datos sobre el mecanismo por el cual la infección trofoblástica por VPH produce una disrupción o disfunción del trofoblasto, y su posible asociación con el parto pretérmino. Las células trofoblásticas extravellositarias fijan la placenta a la pared uterina materna y son responsables del establecimiento de un flujo de baja resistencia de la circulación materna, que suministra nutrientes a la placenta y al feto. El fracaso de la invasión trofoblástica conlleva disfunción placentaria y resultados obstétricos adversos asociados con la disfunción placentaria, y podrían actúar como uno de los mecanismos etiopatogénicos del parto pretérmino. El objetivo de nuestro proyecto es confirmar la asociación e investigar el mecanismo de acción entre la infección genital y trofoblástica por VPH y el incremento de riesgo de parto pretémino. 2) Hipótesis de trabajo 2.1. HIPÓTESIS PRINCIPAL • La infección del tracto genital inferior por el Virus del Papiloma Humano (VPH) durante el tercer trimestre de la gestación se asocia con un incremento del riesgo de parto pretérmino. 2,2. HIPÓTESIS SECUNDARIAS • La infección del tracto genital inferior por VPH durante el tercer trimestre de la gestación se asocia con un incremento del riesgo de infección trofoblástica por VPH. • La infección trofoblástica por VPH produce una disfunción en el desarrollo trofoblástico, que se asocia con un incremento del riesgo del parto pretérmino. • La infección trofoblástica por VPH produce una respuesta inflamatoria placentaria. • La infección trofoblástica por VPH se asocia con alteraciones en la función angiogénica placentaria. 3) Objetivos 3.1. OBJETIVO GENERAL • Determinar la fuerza de asociación entre la infección del tracto genital inferior por el Virus del Papiloma Humano (VPH) y riesgo del parto pretérmino. 3.2. OBJETIVOS CONCRETOS • Determinar la fuerza de asociación entre infección trofoblástica por VPH y riesgo del parto pretérmino. • Determinar la reacción inflamatoria trofoblástica en pacientes con infección por VPH del tracto genital inferior mediante la determinación de RNAm en trofoblasto de IL6, TNF alpha, IFN gamma. • Determinar las modificaciones angigénicas trofoblásticas en pacientes con infección por VPH del tracto genital inferior mediante la determinación de RNAm en trofoblasto de PIGF, FGF, VEGF-A, VEGF-B y VEGF-Receptor. • Determinar la reacción inflamatoria trofoblástica en pacientes con infección por VPH del tracto genital inferior mediante la determinación en sangre de cordón umbilical de IL6, TNF alpha, IFN gamma. • Determinar las modificaciones angiogénicas trofoblásticas en pacientes con infección por VPH del tracto genital inferior mediante la determinación en sangre de cordón umbilical de PIGF, FGF, VEGF. • Determinar la reacción inflamatoria y alteraciones angiogénicas trofoblásticas secundarias a la infección del tracto genital inferior por otros patógenos habituales (Mycoplasma hominis, Ureoplasma species, Clamydia trachomatis), mediante el análisis de RNAm en trofoblasto y su expresión en sangre de cordón. 4) Metodología 4.1. DISEÑO DEL ESTUDIO Para demostrar la hipótesis planteada realizamos un estudio de casos y controles longitudinal prospectivo, que se ha llevado a cabo en el Hospital Clínico Universitario “Lozano Blesa” de Zaragoza, de modo coordinado, por la Unidad de Medicina Materno-Feta del Servicio de Obstetricia y Ginecología, y el Laboratorio de Serología y Virología del Servicio de Microbiología, y con la colaboración del Servicio Científico Técnico de Proteómica y de Secuenciación y Genómica Funcional del IACS (Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud). 4.2. SUJETOS DEL ESTUDIO Los sujetos del estudio se dividen en dos cohortes, reclutadas de acuerdo a los siguientes criterios: 1. Cohorte de partos pretérmino: pacientes gestantes con parto pretérmino.  Criterios de inclusión: • Gestantes con partos entre 26.0 y < 37.0 semanas • Gestaciones únicas • Pacientes que hayan firmado el consentimiento informado.  Criterios de exclusión • Presencia de cromosomopatías y/o patología fetal malformativa • Sospecha clínica de corioamnionitis. • Ingreso por rotura prematura de membranas 2. Cohorte de partos a término: pacientes gestantes sin antecedente de ingreso por amenaza de parto pretérmino.  Criterios de inclusión: • Gestantes con parto a término (igual o superior a 37 semanas de edad gestacional) • Gestaciones únicas • Pacientes que hayan firmado el consentimiento informado.  Criterios de exclusión: • Presencia de cromosomopatías y/o patología fetal malformativa • Sospecha clínica de corioamnionitis. • Ingreso por rotura prematura de membranas 4.3. TAMAÑO DE LA MUESTRA Basándonos en resultados de estudios previos (21), el número de sujetos que es necesario incluir en el estudio para poder detectar diferencias iguales o mayores a un 30% en los la prevalencia de infección trofoblástica por el Virus de Papiloma Humano entre las cohortes estudiadas, asumiendo un error alfa del 5% y un error beta del 20% es de 36 gestantes por rama. Asumiendo una tasa de aceptación del 90% necesitamos incluir en la muestra inicial un total de 41 gestantes en cada rama. Se propone un reclutamiento final de 82 pacientes en el estudio para dar respuesta a los objetivos planteados. 4.4. RECOGIDA DE MUESTRAS, METODOLOGÍA Y ANÁLISIS DE DATOS Las variables de información retrospectivas se obtuvieron, tras consentimiento, de los registros clínicos del Hospital Clínico Universitario. Las variables prospectivas se recogieron de acuerdo a los protocolos estandarizados para cada exploración. Todas las muestras biológicas fueron recogidas y manipuladas de acuerdo con sus protocolos específicos. Las muestras para la detección y tipado por PCR del VPH se realizaron con una torunda seca y estéril, de algodón o alginato. Se introducia la torunda en su tubo sin ningún tipo de medio de transporte y conservaba la muestra a 4ºC, si era procesada antes de 7 días, o a –20ºC si se procesaba después. La detección se llevo a cabo mediante la amplificación de un fragmento de unos 450 pb dentro de la región L1 del virus. La detección y tipado de VPH se realizó por PCR con el equipo Clínical Arrays de Genómica, España). Se recogio sangre venosa del cordón umbilical con un tubo 10 ml de silicona sin aditivos acoplado a vacutainer. La sangre se dejó coagular a temperatura ambiente y se centrifugó durante 20 minutos a 2000g. Se almacenaron alícuotas del suero a -80ªC hasta que fueron analizadas por duplicado en el Analizador multiplex LABSCAN 100 (Luminex). (software LUMINEX 100 IS) Se tomaron dos biopsias de tejido placentario. De forma inmediata se procedió a la conservación del tejido obtenido, para posteriormente extraer el ARN y analizarlo por PCR a tiempo real. Se llevó a cabo la estadística descriptiva univariada, considerando a todos los sujetos seleccionados con el fin de evaluar la tasa y motivos de rechazo, como potencial fuente de sesgo para los resultados. Las variables cualitativas se presentan mediante la distribución de frecuencias de los porcentajes de cada categoría. Para las variables cuantitativas se exploró si siguian o no una distribución normal mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov, y se dan indicadores de tendencia central y dispersión. Se realizó un análisis bivariado y multivariado para investigar los factores relacionados con la presencia o no de antecedente de redistribución hemodinámica cerebral fetal. La asociación entre estos factores se ha investigado mediante pruebas de contraste de hipótesis, con comparación de proporciones cuando ambas eran cualitativas (chi cuadrado, prueba exacta de Fisher); comparaciones de medias cuando una de ellas era cuantitativa (t de Student, ANOVA, y U de Mann-Whitney o Kruskall- Wallis si no siguen una distribución normal); y con pruebas de regresión lineal cuando la variable dependiente era cuantitativa. Adicionalmente se construyeron modelos multivariantes de regresión logística y regresión lineal múltiple, ajustando para las poislbles variables de confusión (p<0,20). El análisis fue complementado con representaciones gráficas. El nivel de significación estadística para este estudio es p < 0,05. Todas las variables fueron registradas en una base de datos previamente diseñada mediante el programa File Maker pro 10. (FileMaker.Inc) El análisis estadístico de los resultados se llevó a cabo con el programa SPSS versión 15.0. (SPSS Inc., Chicago, United States). 4.5. COMITÉ ETICO Y CONSENTIMIENTO INFORMADO El protocolo de investigación propuesto ha sido aprobado por el Comité de Ética de Aragón (CEICA). El consentimiento informado se ha redactado de acuerdo a lo estipulado en el RD 561/1993. 5) Resultados 5.1. ANÁLISIS COMPARATIVOS DEL GRUPO PRETÉRMINO Y A TÉRMINO En primer lugar presentamos los resultados comparando a la muestra incluida según la presencia de parto pretérmino o a término. Si atendemos al nivel educativo de las pacientes, podemos observar que existe una relación inversa entre el nivel educativo y la presencia de parto pretérmino, siendo este más frecuente en pacientes con menos nivel educativo. La edad gestacional en el momento del parto en nuestra muestra, presenta dos picos de máxima frecuencia que corresponden a los pretérminos tardíos (35-36 semanas de gestación) y a los nacidos a término (39-41 de gestación). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes grupos comparados en cuanto a la infección del tracto genital inferior, aunque cabe destacar que todas las infecciones resultaron más frecuentes en el tracto genital inferior de las madres del grupo de nacidos pretérmino que en el grupo a término Una vez realizada la asistencia al parto se recogieron muestras biológicas de sangre de cordón y biopsia placentaria. Se determinaron en todas las muestra de sangre de cordón umbilical los niveles de TNF alfa, IL6, VEGF, IFN gamma, FGF basic y PIGF. Se encontraron diferencias entre las medianas de los dos grupos estudiados para TNF alfa, IL6, FGF basic y PIGF, siendo estas superiores en la sangre de cordon del grupo pretérmino. En general, el grupo pretérmino presentó valores superiores tanto para los biomarcadores inflamatorios como para los determinantes de angiogénesis. Tal y como se recoge en el protocolo del estudio se conservaron muestras de placenta en el momento del parto. Se realizó un análisis de ARNm en tejido placentario para las siguientes moléculas: FGF2, IL6, INFg, TNF, VEGFA, VEGFB y VEGFR1. Los datos sugieren una mayor proporción de casos en el grupo pretérmino en los que encontramos sobreexpresión de RNAm para FGF2, IL6, PGF, TNF, VEGFA y VEGF1. Una vez realizada la asistencia al parto se recogieron además de las muestras de sangre de cordón y biopsia de placenta, dos frotis de placenta uno de cara materna y otro de cara fetal para la determinación y tipado de VPH mediante PCR. En el análisis de las muestras de VPH en trofoblasto, de los 133 casos, tuvimos problemas en 18 casos (13,5%), por lo que finalmente se pudieron analizar muestras placentarias de 115 pacientes. De los casos analizados, fueron negativos para VPH 114, siendo sólo un caso positivo. Dados los resultados de VPH en placenta, el resto de los análisis de nuestro estudio se realizan en función de la presencia de VPH en el tracto genital inferior. 5.2. ANÁLISIS COMPARATIVOS SEGÚN LA PRESENCIA DEL VPH EN EL TRACTO GENITAL INFERIOR A nivel de la sangre de cordón se encontraron diferencias entre las medianas de los dos grupos estudiados para TNF alfa, IL6 e IFN gamma, siendo estas superiores en la sangre de cordón del gurpo de VPH positivo en el TGI, aunque no fueron estadísticamente significativas. También se observó una mayor tendencia a alteraciones del perfil angiogénico en este grupo. A nivel del tejido trofoblastico, las medianas de RNAm de FGF2, IL6, TNF, VEGFA y VEGF1 fueron superiores en el grupo con presencia del VPH en TGI. Esta diferencia fue estadísticamente significativa en el caso del RNA m de VEGFA. Si consideramos inflamación como IL6 y TNF alfa superiores a 1,5 MoM observamos que el grupo que incluye a las pacientes con VPH positivo en TGI es significativamente superior que en el grupo con VPH negativo (40% vs 7,4%) (p 0,004). Todos los RNAm de marcadores de inflamación y de los factores de angiogenesis, excepto de PGF, tendían a valores superiores a 1,5 MoM en presencia del VPH. 5.3. ANÁLISIS COMPARATIVOS EN FUNCIÓN DE LA PRESENCIA DE INFECCIÓN EN EL TRACTO GENITAL INFERIOR Al analizar los niveles de TNF alfa, IL6, VEGF, INF gamma, FGF basic y PIGF en sangre de cordón, en función de la presencia o no de alguna infección en el tracto genital inferior de las madres, no observamos ninguna diferencia estadísticamente significativa, únicamente observamos la tendencia de valores superiores de TNF alfa y PIGF en el grupo con infección del TGI. La placenta de madres con infección del tracto genital por alguno de los patógenos habituales mostró una tendencia a mayor expresión de RNAm de TNF y de biomarcadores de angiogénesis. Al analizar los distintos patógenos del tracto genital inferior y analizar el perfil inflamatorio de las pacientes con infección activa por dichos patógenos, observamos que el que más se relaciona con inflamación trofoblástica, con gran diferencia respecto al resto, es la infección por Clamydia. (p 0,001) 6) Conclusiones 1. No encontramos ninguna asociación entre la infección trofoblástica por VPH y la prematuridad tardía. 2. Los nacidos pretérmino presentaron un mayor perfil inflamatorio y angiogénico en sangre de cordón que los nacidos a término. 3. En las placentas de los recién nacidos pretérmino, se observó una tendencia superior a la sobreexpresión de RNA mensajero para los biomarcadores proinflamatorios y angiogénicos en comparación con las placentas de los nacidos a término. 4. La infección por el VPH en el TGI no se asocia con un incremeneto del parto pretérmino tardío. 5. La infección por VPH en el TGI durante la gestación, se asocia a un con un incremento significativo de inflamación trofoblástica y tendencia a alteraciones del perfil angiogénico en sangre de cordón. 6. En las placentas de madres con infección del TGI por patógenos habituales (Clamydia, Micoplasma y Ureoplasma), se observó una tendencia superior a la sobreexpresión de RNA mensajero para los biomarcadores proinflamatorios y angiogénicos, en comparación con las placentas de madres sin infección. 7)Bibliografía 1. Lumley J. Defining the problem: the epidemiology of preterm birth. Bjog 2003;110 Suppl 20:3-7. 2. Gilbert WM, et al. The cost of prematurity: quantification by gestational age and birth weight. Obstet Gynecol 2003;102:488-92. 3. Bacak SJ, et al. Pregnancy-associated hospitalizations in the United States, 1999-2000. Am J Obstet Gynecol 2005;192:592-7. 4. Palacio M, at al. 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