Caracterización molecular y fenotípica de nuevos genes causales del síndrome Cornelia de Lange

Resumen

El Síndrome de Cornelia de Lange (SCdL) es una patología del desarrollo de origen genético que se caracteriza por unos rasgos faciales distintivos, retraso pondoestatural y psicomotor, discapacidad intelectual, malformaciones de las extremidades, hirsutismo y afectación variable de otros sistemas. La prevalencia del síndrome se estima entre 1/45.000 ¿ 1/62.000 recién nacidos vivos. Tiene una herencia autosómica dominante (NIPBL, SMC3, RAD21) o ligada al X (SMC1A, HDAC8), siendo la mayoría de los casos esporádicos, aunque también existen casos familiares. Los cinco genes causales tienen en común codificar componentes estructurales o reguladores del complejo cohesina, y en conjunto las mutaciones de estos genes afectan al 80% de los individuos con SCdL. El complejo cohesina es esencial en el funcionamiento de muchos procesos biológicos, entre los que destacan la segregación cromosómica, la reparación del DNA, la regulación de la expresión génica y la remodelación de la cromatina. El complejo tiene forma de anillo que rodea la cromatina y está formado por diferentes componentes estructurales primarios (SMC1A, SMC3, RAD21/REC8 y STAG-1+2+3) y componentes secundarios asociados (ESCO2, HDAC8, PDS5A/B, WAPL, MAU2 y NIPBL). Estos dos últimos, NIPBL y MAU2, conforman a su vez un heterodímero denominado ¿Adherina¿ o más recientemente ¿kollerina¿, que facilita la carga del anillo de cohesina a la cromatina. En esta tesis doctoral se han perseguido varios objetivos, comenzando en un primer lugar por la identificación de nuevos genes causales del SCdL en pacientes con fenotipo compatible. Además, una vez que los pacientes disponían de diagnóstico molecular, se ha profundizado en la caracterización de sus fenotipos asociados, e incluso en el estudio de casos de coexistencia de más de un síndrome. Por último, con el objeto de ahondar en los mecanismos fisiopatológicos subyacentes, se ha llevado a cabo la caracterización de la interacción de NIPBL con otras proteínas del complejo cohesina. Los dos primeros trabajos, son fruto de una revisión detallada de los antecedentes y estado actual del SCdL al principio de esta tesis doctoral. El primer trabajo de carácter científico-educativo, está dirigido a estudiantes y profesionales de la medicina. El segundo trabajo está diseñado como una herramienta de ayuda al diagnóstico para el profesional sanitario. En el tercer trabajo, se participó en el descubrimiento del tercer gen causal, SMC3, con la identificación de una deleción in-frame en un único paciente. Además se hallaron 8 mutaciones diferentes en SMC1A, que mantenían el marco de lectura. En estos casos, el mecanismo patogénico se asociaba al efecto negativo dominante de la proteína mutada, y aunque pudieran formarse complejos de cohesina activos, la dinámica de unión a los cromosomas podía verse alterada. El fenotipo asociado fue similar en ambos sexos, con unos rasgos clínicos más discretos que el SCdL clásico, menor retraso pondoestatural, ausencia de grandes anomalías estructurales y discapacidad intelectual variable. En el cuarto trabajo, se llevó a cabo el primer estudio molecular de los genes: NIPBL, SMC1A y SMC3, en población española, permitiendo identificar 11 mutaciones en el gen NIPBL, y 3 en el SMC1A. En cambio en el gen SMC3, tan sólo se encontraron 29 polimorfismos. Las correlaciones genotipo-fenotipo mostraron un cuadro clínico más grave en los pacientes NIPBL-positivos que en los SMC1A-positivo o sin diagnóstico genético. Los pacientes con mutaciones en el gen SMC1A destacaron por tener la incidencia más alta de alteraciones en el paladar y uno de ellos padeció un complejo Sandifer. En el quinto trabajo, se participó en el descubrimiento del cuarto gen causal, RAD21, identificándose seis pacientes que portaban 4 deleciones intragénicas y 2 mutaciones missense. Sus rasgos faciales se solapaban con los característicos del SCdL pero eran más discretos. Además, presentaban en menor grado discapacidad intelectual, retraso en el crecimiento y anomalías musculoesqueléticas. Las mutaciones identificadas en RAD21 alteraban su interacción con los componentes de las cohesinas SMC1A y STAG1+2, y tres funciones básicas del complejo: la cohesión de las cromátides hermanas, la respuesta al daño celular y la regulación de la expresión génica. Además, los resultados mostraban que la mutación missense que presentaba una actividad adicional, generaba mayores defectos funcionales y causaba unos rasgos clínicos estructurales y cognitivos más graves, que la otra mutación missense asociada a una pérdida de función. En el sexto trabajo, se reportó el hallazgo de 21 mutaciones en el gen HDAC8 y se describieron las características clínicas presentes en los 38 individuos identificados hasta ese momento. El patrón de herencia estaba ligado al X, por lo que los varones presentaban un fenotipo con mayor grado de afectación sistémica, mientras que las mujeres tenían más variabilidad clínica. Además, la heterogeneidad del sexo femenino parecía relacionada con el grado de inactivación del cromosoma X. Los pacientes con mutaciones en HDAC8 presentaban una facies y afectación orgánica similar al SCdL clásico, aunque también mostraban rasgos clínicos distintivos como cierre de la fontanela anterior tardío, hipertelorismo ocular, párpados redundantes, punta nasal ancha o bulbosa y diastema dentario en los incisivos superiores. También se valoró el efecto funcional de las mutaciones mediante su localización en la estructura cristalina previamente descrita, y la medición de su actividad enzimática, demostrándose la pérdida de función como mecanismo patológico. En el séptimo trabajo, se confirma que el gen SMC3 puede producir el síndrome, gracias al hallazgo de 15 pacientes SMC3-positivos, después de ocho años de la descripción del primer paciente. Además, se caracteriza el fenotipo asociado a este gen, similar al de los pacientes SMC1A, pero que difiere del clásico de los NIPBL-positivos. Los pacientes muestran una microcefalia postnatal con un fenotipo facial distintivo alrededor de la región periorbital y nasal, leve retraso en el crecimiento prenatal que empeora durante la infancia, defectos cardiacos congénitos, ausencia de reducción de las extremidades y discapacidad intelectual aunque sin graves problemas de comportamiento. El análisis de las mutaciones sugiere que aquellas que no alteran el marco de lectura actúan mediante un efecto dominante negativo, sin embargo, la identificación de la primera mutación nonsense apoya la haploinsuficiencia o la pérdida de función como mecanismo concurrente. En el octavo trabajo, se describe el caso clínico de una paciente que presentaba simultáneamente SCdL debido a una mutación en el gen NIPBL, y Síndrome de Turner con cariotipo mosaico 45,X/46,XX. Esta coincidencia de dos entidades nosológicas y la observación de que ontogenéticamente la mutación del gen NIPBL aparecería antes que la aneuploidía del cromosoma X, apoyaba la hipótesis de que las mutaciones del complejo de cohesinas podían relacionarse con alteraciones en la segregación de los cromosomas. En el último trabajo, se caracterizó la interacción de las proteínas NIPBL y MAU2, y se evaluó la importancia de esta interacción en el fenotipo del síndrome. Se refinaron los límites de los dominios de interacción, confinándolos a los primeros 38 residuos de NIPBL y a los aminoácidos Phe32-Leu71 de MAU2. Posteriormente, la valoración del efecto de las mutaciones demostró que tan sólo dos de las ocho, que estaban en estos dominios, reducían la capacidad de unión de NIPBL con MAU2. Sin embargo, no se apreciaron diferencias significativas entre el fenotipo de los pacientes con estas mutaciones, y el grupo control u otros pacientes con mutaciones missense en NIPBL, sugiriéndose que otros factores adicionales a MAU2 podrían determinar las características clínicas y la gravedad del síndrome.