Estudio del splicing fisiológico y patológico de los genes nipbl, hmgcl y hmgcs2, que causan el síndrome Cornelia de Lange y las deficiencias de hmg-coa liasa y sintasa mitocondrial humanas

Resumen

La mayoría de los genes de eucariotas superiores son discontinuos, compuestos por pequeños fragmentos codificantes llamados exones, que están interrumpidos por secuencias mucho más largas de función no bien definida y que conocemos como intrones. Para que se lleve a cabo adecuadamente la síntesis proteica, es necesario eliminar del mRNA los intrones y unir los exones entre sí. El proceso por el cual se realiza todo esto es conocido con el anglicismo de splicing, y es llevado a cabo por una compleja maquina proteica denominada espliceosoma. Todo este mecanismo funciona gracias a la existencia de un código de señales, no siempre bien conocidas, entre las que se incluyen las secuencias consenso que delimitan las zonas de corte. En eucariotas superiores la aparición del splicing alternativo ha facilitado la expansión del transcriptoma, permitiendo generar diferentes proteínas a partir de un mismo gen. Actualmente, se estima que el 95% de los genes de mamíferos están sujetos a fenómenos de splicing alternativo. De hecho, existe una buena correlación entre complejidad de este proceso y evolución filogénica. En las enfermedades de origen genético un importante porcentaje de pacientes presentan mutaciones que afectan al splicing. Éstas frecuentemente provocan la aparición de tránscritos aberrantes, o alteran, en otras ocasiones, las proporciones de los tránscritos fisiológicos. Pero en cualquier caso, la consecuencia de todo ello suele ser siempre la misma, la aparición de la enfermedad. El objetivo general de este trabajo ha sido caracterizar el splicing fisiológico y patológico de los genes NIPBL, HMGCL y HMGCS2, que causan el síndrome Cornelia de Lange (SCdL) y las deficiencias de HMG-CoA liasa y HMG-CoA sintasa mitocondrial humanas. Se trata de tres enfermedades raras de origen genético, en las que el estudio de sus genes y mutaciones causales resulta fundamental para su mejor conocimiento. En el primer trabajo de esta memoria se realiza una revisión de la importancia de las mutaciones de splicing en las enfermedades de origen genético. En él, se hace un detallado análisis del proceso de splicing y de los elementos de secuencia necesarios. También se describen los diferentes tipos de mutaciones de splicing y sus consecuencias en el procesamiento del mRNA, utilizando ejemplos ilustrativos, que han sido obtenidos principalmente en la investigación de los genes HMGCL y NIPBL llevada a cabo por nuestro grupo. En el segundo trabajo se realiza un estudio coordinado del splicing fisiológico de los genes HMGCS2 y HMGCL, que permite descubrir la variante HMGCS2¿4 en el gen HMGCS2, y las variantes HMGCL¿5,6 y HMGCL¿5,6,7 en el gen HMGCL. Sin embargo, su sobreexpresión, no permite la recuperación de la proteína en la fase soluble, y el ensayo enzimático resulta negativo, por lo que probablemente son variantes inactivas que no dan lugar a proteínas. Mediante qPCR en diferentes tejidos se observa una mayor expresión de estas variantes en tejidos no cetogénicos, lo que lleva a sugerir su posible papel como reguladores negativos de la cetogénesis. El tercer trabajo consiste en el estudio funcional de dos de las tres mutaciones más frecuentes del gen HMGCL, en 7 pacientes con deficiencia de HMGC-CoA liasa. La primera es la mutación c.109G>T, que produce un tránscrito aberrante con pérdida del exón 2. Aunque este cambio resulta crítico para el splicing, no parece estar vinculado a los mecanismos de NAS o NMD. La segunda, la deleción c.504_505delCT genera un tránscrito aberrante con pérdida del exón 6 y aumenta la proporción de la variante fisiológica HMGCL¿5,6, probablemente debido a la activación de un mecanismo de NMD que degrada los tránscritos con codones stop prematuros. El cuarto trabajo supone la primera búsqueda sistemática de variantes fisiológicas de splicing en el gen NIPBL, junto con el mayor análisis de mutaciones de splicing en este gen en pacientes con SCdL. A nivel fisiológico, se confirma por primera vez la presencia de la isoforma B en el cDNA obtenido de leucocitos humanos adultos, y se identifican cuatro nuevas variantes de splicing, ¿E10, ¿E12, ¿E33,34 y B¿. A nivel de mutaciones, se caracterizan ocho mutaciones de splicing en 12 pacientes con SCdL, siete de ellas nuevas. Además, el estudio del RNA permite descartar el cambio c.6109-3T>C como mutación de splicing. Por último, este trabajo confirma que entre la amplia variabilidad clínica que presentan los pacientes de SCdL con mutaciones de splicing, los fenotipos más graves se asocian a mutaciones que generan tránscritos aberrantes con ruptura del marco de lectura. El quinto trabajo consiste en el estudio funcional de dos mutaciones intrónicas del gen NIPBL, que son capaces de alterar el splicing a pesar de estar alejadas de las posiciones canónicas de consenso. La mutación c.5329-15A>G afecta probablemente al punto de ramificación, y genera un tránscrito aberrante que mantiene el marco de lectura. Esta mutación no afecta el nivel de expresión de NIPBL y cursa con un fenotipo leve. Por su parte, la deleción c.6344del(-13)_(-8) afecta al tramo de polipirimidinas, y genera un tránscrito aberrante con ruptura del marco de lectura, que cursa con una marcada disminución de la expresión de NIPBL. Esta disminución indica una haploinsuficiencia, que se correlaciona bien con el grave fenotipo de la paciente