Caracterización génica y bioquímica de una ciclodextrin glucanotransferasa, enzima implicada en el metabolismo del almidón en Haloferax mediterranei

  1. BAUTISTA SAIZ, VANESA
Supervised by:
  1. María-José Bonete Director
  2. Julia M. Esclapez Espliego Co-director

Defence university: Universitat d'Alacant / Universidad de Alicante

Fecha de defensa: 07 June 2010

Committee:
  1. Jesús Díez Dapena Chair
  2. Mónica L. Camacho Carrasco Secretary
  3. María Jesús Llama Fontal Committee member
  4. Antonio Ventosa Ucero Committee member
  5. José Berenguer Carlos Committee member

Type: Thesis

Teseo: 293007 DIALNET lock_openRUA editor

Abstract

Haloferax mediterranei es un microorganismo halófilo extremo clasificado dentro del Domino Archaea. Este microorganismo es capaz de crecer en medio mínimo con acetato amónico como única fuente de carbono y nitrógeno. Cuando este medio es suplementado con almidón, Hfx. mediterranei secreta al medio extracelular una enzima con actividad amilolítica. Tras purificar y caracterizar esta enzima, se ha comprobado que se trata de una ciclomaltodextrin glucanotransferasa (CGTasa). Hasta el momento es la única CGTasa secuenciada y caracterizada en un halófilo extremo del Dominio Archaea. Las CGTasas (EC 2.4.1.19) son enzimas capaces de degradar almidón convirtiéndolo principalmente en ciclodextrinas (CDs). Estas CDs son oligosacáridos cíclicos no reductores constituidos por 6 (alfa-CD), 7 (beta-CD) u 8 (gamma-CD) unidades de glucosa unidas por enlaces glucosídicos alfa-1,4. Además de esta actividad de ciclación, estas enzimas catalizan otras tres reacciones bien diferenciadas: acoplamiento, transferencia e hidrólisis. En la actualidad las CDs son ampliamente estudiadas por su potencial biotecnológico, ya que debido a su estructura pueden formar complejos de inclusión con gran variedad de moléculas. Debido a esta propiedad, las CDs han sido utilizadas para la estabilización y solubilización de un gran número de sustancias de interés en la industria farmacéutica, cosmética o alimentaria, así como en procesos de bioconversión y separación. Mediante la digestión con tripsina de la enzima purificada, se obtuvieron una serie de péptidos que se emplearon como sonda en la búsqueda del gen en una librería genómica de Hfx. mediterranei en fago lambda. Una vez aislado el gen, se secuenció y analizó bioinformáticamente. Además, se han secuenciado y analizado cuatro genes adyacentes que forman parte de un transportador de maltosa tipo ABC (malE, malF, malG y malK). Con el fin de estudiar en el futuro sus propiedades estructurales, se expresó el gen de la CGTasa de Hfx. mediterranei en el huésped mesófilo E. coli, obteniéndose la proteína activa en la fracción citoplasmática soluble. El proceso de purificación desarrollado es rápido y eficaz, consiguiéndose la enzima pura y concentrada en un solo paso cromatográfico. La caracterización de la CGTasa recombinante reveló que las propiedades moleculares y cinéticas de esta enzima son prácticamente idénticas a las que presenta la CGTasa aislada de Hfx. mediterranei.