Sublethal effects of chemical pollution in benthic fish species from marine Spanish waters

Resumen

i) Introducción Cada día miles de sustancias químicas potencialmente tóxicas son introducidas en los océanos. Sin embargo, incluso después de décadas de investigación y seguimiento de la contaminación química, todavía existe un conocimiento limitado de los efectos que causan los contaminantes químicos en los organismos y ecosistemas marinos. Un factor que complica aún más este asunto es la ausencia, de manera general, de una relación directa entre las elevadas concentraciones de contaminantes encontradas en los tejidos de los organismos y sus efectos biológicos. Además, se ha demostrado que algunas respuestas biológicas se producen incluso tras la exposición a concentraciones muy bajas de contaminantes. El uso y desarrollo de medidas de efectos biológicos (biomarcadores y bioensayos) que actúan como señales de alerta temprana de los cambios ambientales adversos en los ecosistemas marinos, junto con la química analítica, ha ido aumentando y es cada vez más utilizada. Las repuestas biológicas relacionadas con la exposición a contaminación química incluyen respuestas fisiológicas o bioquímicas en los organismos expuestos a ciertas clases de contaminantes. Las respuestas de biomarcadores en peces procedentes de poblaciones naturales resultan más sensibles que otro tipo de métodos, ya que proporcionan información integrada de la exposición a contaminantes y de sus efectos además de indicar incidencias por contaminación aguda. Los bioensayos in vivo e in vitro contribuyen a nuestro entendimiento de cómo los contaminantes afectan a los organismos, ayudan en la deducción de sus principios generales de mecanismos de acción, así como en la categorización y en la valoración general de los efectos. Los peces son la clase de vertebrados más diversa y su uso en los estudios de ecotoxicología permite enlazar la salud humana y la ecológica. Los peces bentónicos son además organismos especialmente apropiados para realizar estudios de contaminación química marina y la valoración de su estado de salud no es sólo un tema de interés conservacionista sino que también tiene claros vínculos en relación a su utilización como recursos marinos y en relación a la salud humana. En el momento de inicio de esta tesis doctoral, la mayoría de los estudios ambientales sobre la contaminación química en peces de aguas españolas abordaban procesos de bioacumulación de contaminantes en tejidos como forma de valorar el grado de exposición de los peces a éstos así como para valorar los riesgos en la salud humana asociados al consumo de estos organismos. De hecho, los estudios de investigación y los programas de seguimiento de la contaminación química marina estaban predominantemente realizados con mejillones, seguidos por otros invertebrados marinos., mientras que era más limitado en peces, siendo el salmonete de fango (Mullus barbatus) de aguas mediterráneas la principal especie estudiada. Por otro lado, la valoración de los efectos biológicos causados en peces por la exposición ambiental a sustancias químicas no estaba implementada dentro de los programas de seguimiento de la contaminación marina en España, siendo los datos sobre las respuestas de biomarcadores de contaminación en peces muy escasos o inexistentes, en el caso de los peces de las aguas de la plataforma norte española. Además, las especies de peces bentónicas recomendadas por los grupos de expertos para ser utilizadas como especies objetivo en aguas del Atlántico (tales como el bacalao, la platija o el lenguado) no se encuentran en cantidades suficientes para ser utilizadas a escala regional en estudios a lo largo de la plataforma norte española. Por lo tanto, existía una necesidad de evaluar qué especies eran las más idóneas en esta región marítima española. Por otra parte y tras el hundimiento del petrolero ¿Prestige¿ (España, 2002), la comunidad científica europea y los gestores ambientales destacaron la necesidad de desarrollar unas directrices estandarizadas con las cuales realizar un seguimiento de la contaminación por vertidos marinos de petróleo integrando tanto las medidas químicas como las biológicas. Los principales objetivos de esta tesis han sido esclarecer los efectos subletales que los contaminantes químicos ambientales causan sobre ciertas respuestas biológicas en tres especies de peces bentónicos de aguas marinas españolas (Lepidorhombus boscii, Callionymus lyra y Mullus barbatus) así como desarrollar el uso de éstas respuestas biológicas en peces dentro de un marco de trabajo integrado para los futuros programas de seguimiento de la contaminación ambiental marina en España. ii) Desarrollo teórico Esta tesis consta de cinco artículos científicos [I-V], todos ellos publicados en revistas internacionales revisadas por expertos. Los peces bentónicos fueron muestreados en diferentes escenarios ambientales: i) en la plataforma norte ibérica poco después de un vertido de petróleo de dimensiones medias, ii) y repetidamente durante un periodo de tres años y en las mismas áreas, iii) en áreas de la plataforma interna mediterránea española afectadas por la contaminación crónica iv) y en la laguna costera del Mar Menor (SE España). En todos los escenarios, los peces fueron también muestreados simultáneamente en áreas de referencia para permitir comparaciones directas de los datos. Se desarrollaron e implementaron protocolos estandarizados para minimizar la variabilidad debida a factores biológicos y ambientales. Además de su uso directo, los métodos fueron evaluados y tanto los datos de los estudios de campo como los de laboratorio fueron utilizados para desarrollar un marco de trabajo con el que realizar el seguimiento de la contaminación química en los ecosistemas marinos. Las medidas biológicas investigadas en esta tesis comprenden biomarcadores de contaminación química ya validados en otras especies, tales como las enzimas de detoxificación relacionas con la fase I de biotransformación, p.e. la actividad etoxyresorufin-O-deetilasa (EROD) y las concentraciones biliares de metabolitos hidroxilados de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs). Otros biomarcadores relacionados con la exposición a contaminantes y cuya aplicabilidad en peces marinos es todavía objeto de discusión, tales como las enzimas relacionadas con los procesos de biotransformación de fase II (actividad glutation-S-transferasa (GST), enzimas antioxidantes (glutatión reductasa (GR) y catalasa (CAT), metalotioneínas (MT) y la integridad del ADN, fueron también estudiados en esta tesis. Asimismo, el ensayo in vitro de gen informador ER-LUC también fue utilizado como una herramienta de criba con la cual estimar la exposición total a compuestos activos estrogénicos en peces y para evaluar la potencia estrogénica de los compuestos HAPs hidroxilados y alquilfenoles. En el Capítulo 2 se presentan los resultados de los análisis de una serie de biomarcadores hepáticos cinco meses después del vertido del petrolero Prestige en dos especies de peces bentónicos: el gallo de cuatro manchas (L. boscii) y el dragoncillo (C. lyra). Los peces fueron capturados en diferentes áreas a lo largo de la plataforma norte Ibérica con el fin de evaluar la extensión espacial de los efectos causados por el vertido de petróleo, así como para evaluar las respuestas especie- dependientes [artículo I]. En el momento de iniciarse este estudio no existían datos disponibles acerca de las concentraciones de contaminantes químicos en las especies utilizadas y provenientes de estas áreas. Las respuestas de los biomarcadores sugirieron, sin embargo, que los peces de ciertas áreas estaban ya afectados por la contaminación crónica existente antes de que se produjera el vertido del petrolero Prestige. La ausencia de datos de biomarcadores en estas especies previos al vertido hizo imposible que se pudieran atribuir directamente los efectos biológicos observados en los peces a los componentes de hidrocarburos del petróleo vertido. Como continuación, en el capítulo 3 se presenta el estudio realizado para determinar si las respuestas de los biomarcadores, en las mismas especies L. boscii y C. lyra, variaban durante los siguientes años tras el vertido del Prestige [artículo II]. Los resultados indicaron una disminución significativa de las respuestas biológicas asociadas a hidrocarburos a lo largo del tiempo así como una recuperación con posterioridad a los presuntos niveles basales. En general, las respuestas de los biomarcadores estuvieron en concordancia con las trayectorias de las mareas negras y la distribución espacial de las bolas de alquitrán encontradas sobre los fondos de la plataforma marina tras el accidente. Los resultados de estos estudios mostraron que los efectos subletales en peces bentónicos duraron al menos 2-3 años tras el vertido y han sido los primeros en mostrar que un vertido de petróleo en mar abierto puede afectar a los peces bentónicos que habitan a cientos de kilómetros del punto de vertido. El capítulo 4 presenta un documento guía que fue preparado para formalizar el diseño de muestreo, la selección de las especies y la selección de las técnicas de efectos biológicos apropiadas. Las directrices están enfocadas particularmente a la valoración de la toxicidad y a las estrategias para el seguimiento de los efectos biológicos asociados a los vertidos de petróleo, con particular referencia a las aguas costeras europeas [artículo III]. El documento guía concluye que es crítico tener en marcha programas de seguimiento de los efectos biológicos de la contaminación química en aquellas áreas con alto riesgo de accidentes por vertidos de petróleo. En el capítulo 5, se realizó un estudio integrado para aclarar si las concentraciones de contaminantes en áreas costeras de la plataforma interna mediterránea española y sometidas a contaminación crónica, se encontraban en niveles que causaran efectos adversos sobre la salud del pez bentónico Mullus barbatus [artículo IV]. El estudio combinó análisis químicos en biota y sedimentos superficiales, repuestas de biomarcadores así como indicadores del estado reproductivo y nutricional de los peces. El estudio incluyó un área costera dominada por la contaminación metálica (Portmán, SE España). Los resultaros mostraron alteraciones en ciertos biomarcadores, p.e. actividad EROD, integridad del ADN, contenido lipídico en músculo e índice gonadosomático, en los peces capturados en áreas más contaminadas, aunque las respuestas no fueron dramáticas. La carga corporal contaminante en los peces reflejó de manera parcial la presencia de los mismos contaminantes en los sedimentos de las áreas de estudio. Esto presumiblemente fue debido a las diferencias de biodisponibilidad y a la capacidad metabólica de biotransformación de los peces. Finalmente, el Capítulo 6 presenta un estudio químico y biológico integrado para valorar la exposición a contaminantes estrogénicos en salmonetes de fango machos [artículo V]. El uso del ensayo in vitro de gen informador ER-LUC se utilizó en combinación con análisis químicos en extractos de bilis y puso de manifiesto algunos de los desafíos de los análisis químicos, ya que una fracción mínima del total de la actividad estrogénica observada en los peces pudo ser explicada por las concentraciones de sustancias estrogénicas encontradas en los análisis químicos. iii) Conclusiones Los estudios incluidos en esta tesis han proporcionado nuevos conocimientos sobre como el petróleo y los contaminantes químicos afectan a las especies de peces bentónicos en aguas marinas españolas. Esta tesis ha mostrado que los biomarcadores y los bioensayos in vitro con extractos de bilis son herramientas útiles para cuantificar efectos subletales en peces expuestos a contaminantes químicos conocidos y no conocidos. Los resultados obtenidos durante esta tesis han permitido obtener una serie de conclusiones específicas que han sido descritas en sus correspondientes capítulos, y que son resumidas a continuación: El gallo de cuatro-manchas (Lepidorhombus boscii), el dragoncillo (Callionymus lyra) y el salmonete de fango (Mullus barbatus) son adecuadas especies de peces bentónicos para ser utilizadas como especies objetivo en los programas de seguimiento de los efectos biológicos de la contaminación química en aguas españolas. 1. Los cambios temporales de las actividades hepáticas etoxyresorufin-O-deetilasa (EROD), catalasa (CAT) y glutatión reductasa (GR) en el gallo de cuatro manchas y en el dragoncillo a lo largo de la plataforma norte ibérica mostraron que los peces estuvieron expuestos a hidrocarburos derivados del vertido del petrolero Prestige y que tales efectos fueron evidentes más de dos años tras el vertido. 2. Las diferencias espaciales en las actividades hepáticas EROD, CAT y GR en el gallo de cuatro manchas y en el dragoncillo, a lo largo de la plataforma norte ibérica, mostraron que un vertido de petróleo en aguas abiertas puede afectar a los peces bentónicos de áreas costeras y profundas localizadas a cientos de kilómetros de distancia. 3. La actividad hepática EROD en salmonete de fango reflejó la exposición a contaminantes químicos orgánicos. 4. La actividad hepática glutation-S-transferasa (GST) en el gallo de cuatro manchas y en dragoncillo, cuantificada utilizando 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB) como sustrato, no reflejó exposición a contaminantes. 5. Las concentraciones hepáticas de metalotioneínas en salmonete de fango no reflejaron la exposición ambiental a metales pesados. 6. Las roturas en la cadena de ADN en el hígado de los peces, medidas utilizando el método de elución alcalina, reflejaron exposición a compuestos genotóxicos ambientales en salmonete de fango, mientras que los resultados no fueron claros en el gallo de cuatro manchas y en dragoncillo. 7. La concentración de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) hidroxilados y alquilfenoles en bilis de salmonete de fango reflejó la exposición ambiental predicha en los sitios localizados a lo largo de la costa mediterránea española, destacando particularmente la elevada exposición a HAPs en la laguna del Mar Menor. 8. La estrogenicidad in vitro determinada en extractos de bilis de peces macho mostró que los salmonetes de fango de la laguna del Mar Menor están expuestos a concentraciones altas de compuestos estrogénicos activos en comparación con los peces machos del área de referencia. 9. Los metabolitos hidroxilados del naftaleno (1-naftol), pireno (1-pirenol), y benzo[a]pireno (1-OH-BaP y 3-OH-BaP) tienen una potencia estrogénica menor que la de los alquilfenoles. 10. Los compuestos estrogénicos hidroxilados de HAPs y los alquilfenoles contribuyeron mínimamente a la actividad estrogénica total encontrada en la bilis de los salmonetes de fango machos. 11. Los efectos biológicos en peces pueden no estar directamente correlacionados con la carga contaminante en sus tejidos o con las concentraciones de contaminantes en matrices abióticas tales como los sedimentos marinos. 12. La contaminación metálica extrema de los sedimentos marinos no se traduce necesariamente en efectos deletéreos severos sobre el estado de salud de las especies de peces bentónicos tales como el salmonete de fango. 13. La información sobre las condiciones ambientales y las características fisiológicas de los organismos estudiados, p.e. peces, es crucial para distinguir entre las respuestas relacionadas con procesos naturales y las respuestas relacionadas con la contaminación. 14. La existencia de programas en curso de seguimiento de la contaminación que estén basados en el estudio de los efectos biológicos en zonas con alto riesgo de accidentes por vertidos de petróleo resulta fundamental para poder sentar las bases y evaluar los impactos causados por un derrame de petróleo.