Biomarker identification in two neurológical conditions promoted by inflammatory componentsmultiple sclerosis and stroke-associated atheroma plaques

Resumen

La inflamación se ha relacionado con el desarrollo de diversas enfermedades, incluyendo la esclerosis múltiple (EM) y la aterosclerosis asociada a infarto cerebral. De hecho, varios fármacos que tienen como diana componentes inflamatorios han demostrado ser beneficiosos en el tratamiento de dichas enfermedades (por ejemplo, el interferón beta para la EM y las estatinas para la aterosclerosis). Mi trabajo se centra en las mencionadas enfermedades (la EM y la aterosclerosis asociada a infarto cerebral), en las que la inflamación subyace la severidad de la enfermedad o el desarrollo de complicaciones clínicas. ESCLEROSIS MÚLTIPLELa esclerosis múltiple (EM), una enfermedad crónica y progresiva del sistema nervioso central, se caracteriza por inflamación crónica, desmielinización, pérdida de oligodendrocitos y daño axonal. Se cree que la etiología de la enfermedad, que afecta principalmente a adultos jóvenes, está mediada por células T que causan reacciones autoinmunes contra la sustancia blanca del cerebro. Aunque inicialmente se creía causada por agentes ambientales, el papel de la genética se detectó por primera vez gracias a estudios de ligamiento en familias y estudios de asociación, que dieron lugar a la identificación del primer locus de riesgo: la región HLA. Desde el primer estudio de genoma completo, realizado en 2007, hasta hoy, se han identificado varios genes de susceptibilidad para la EM, entre ellos CD58, RPL5, EVI5, IL7R, IL2RA, CD6, TNFRSF1A, CLEC16A, IRF8, CD226, TYK2, SOCS1, STAT3, BCL2 y MPHOSPH9. El estudio inicial consistió en la validación de algunos de estos genes en nuestra colección de Bilbao, la cual incluía 588 casos and 567 controles, donde encontramos asociaciones en marcadores de los genes TNFRSF1A (rs1860545) y CD6 (rs17824933), hallando en este último la asociación más fuerte (OR = 1.34). Por lo tanto, estudiamos marcadores adicionales para cubrir toda la región CD6 en 814 MS pacientes con EM 814 controles sanos, seleccionando nueve SNPs marcadores de haplotipo dentro del gen CD6, entre ellos tres SNPs exónicos no-sinónimos SNPs (rs11230563 (R225W) y rs2074225 (A257V) localizados en el segundo dominio SCRC (exón 4) y rs12360861 (A271T) en el tercer dominio SCRC (exón 5)) y rs17824933, que fue el primer SNP de CD6 asociado con la EM en los estudios realizados para identificar la variante causal de la susceptibilidad y entender sus implicaciones funcionales. El análisis se realizó mediante PLINK (versión 1.07), y la tasa de éxito de genotipado fue >95%. Cuatro de los trece marcadores se encontraron asociados con la susceptibilidad, aparte de rs17824933. El SNP no-sinónimo rs2074225 contribuyó al efecto más fuerte (P = 3.1 ¿ 10-6, OR = 1.4). Estos marcadores, junto con un SNP no-sinónimo adicional (rs11230563, seleccionado porque mostró una tendencia hacia la asociación) fueron analizados en una cohorte de replicación que incluía un total de 2265 pacientes y 2600 controles provenientes de Andalucía, Madrid y caucásicos americanos de la Universidad de California, San Francisco (UCSF).La prueba de Breslow-Day para la cohorte combinada (la cual incluye la cohorte vasca y la cohorte de replicación) reveló la ausencia de heterogeneidad, permitiéndonos realizar un análisis combinado mediante la prueba de Cochran-Mantel-Haenzel (CMH). El análisis demostró asociación de dos marcadores noveles: rs11230559 (PCMH (combined) = 0.005, OR = 1.15) y rs2074225 (PCMH (combined) = 0.0065, OR = 1.14) (Tabla 2). El SNP rs11230559 se encontró en fuerte desequilibrio de ligamiento (LD) con el marcador original, rs17824933. Estos dos marcadores también estaban en LD con un SNP no-sinónimo localizado en el segundo dominio SCRC de CD4, en el exón 4 (rs11230562).Se realizó un análisis de haplotipos en la cohorte combinada con el objetivo de identificar los marcadores que influyesen más en el efecto. Este análisis se llevó a cabo mediante el método de ¿sliding window¿ en los seis marcadores (los cinco que mostraron asociación en la prueba de CMH y un SNP no-sinónimo adicional) en combinaciones de dos, tres y cuatro marcadores, en la cohorte combinada. El análisis de haplotipos, en el que se compararon las combinaciones de dos marcadores (tanto derivados del análisis de ¿sliding window¿ como de otros marcadorres con los dos SNPs no-sinónimos) reveló una fuerte asociación del haplotipo que contenía los dos SNPs no-sinónimos rs11230563-rs2074225 (P=1.61 ¿ 10-5). El análisis con tres y cuatro marcadores (¿sliding window¿) también mostró efectos más fuertes cuando se combinaban con uno o ambos SNPs no-sinónimos.Basándonos en esta observación, extendimos el estudio para identificar cambios en la expresión de CD6 en diferentes tipos celulares, utilizando citometría de flujo en células mononucleares de sangre periféricas (PBMCs) segredadas dependiendo de su haplotipo rs11230563-rs2074225. Esta parte del trabajo se realizó en el laboratorio de la Profesora Eva Tolosa en la UKE, Hamburgo. Se extrajeron 27 muestras de PBMCs de pacientes de la cohorte de Andalucía y en ellas se estudiaron los cambios de expresión de CD6 entre las células T CD4+ y CD8+ , células NKT y células NK (NK Bright, NK Dim) y células CD8+ efectoras (células de memoria centrales, de memoria efectoras, vírgenes, CD28+, CD28-). El análisis reveló una mayor diferencia de efectos en la expresión entre las células CD4+ vírgenes (PANOVA > 0.0001) y las células CD8+ vírgenes (PANOVA > 0.0001). Estos resultados indicaron que el haplotipo que contenía los dos marcadores no-sinónimos (rs11230563 y rs2074225) confiere un fuerte efecto funcional que conduce a cambios de expresión en diferentes tipos celulares. También realizamos experimentos para identificar la expresión diferencial de citokinas secretadas en muestras con diferentes haplotipos rs11230563-rs2074225 tras la estimulación de CD3 mediante anticuerpos monoclonales (con o sin coestimulación de CD6) y mediante ALCAM-Fc dirigido al dominio 3. Se realizó cuantificación de diferentes citokinas (IL-2, IL-17 y IFN-¿) en el sobrenadante de los cultivos celulares mediante kits de ELISA. Los resultados mostraron diferencias significativas en la secreción de IFN-¿ entre los haplotipos en células estimuladas con anti-CD3 y también en células coestimuladas con ALCAM-Fc (IFN-¿, POKT3 stimulated = 0.0099, POKT3+ ALCAM-Fc stimulated = 0.014).Los resultados de la citometría de flujo indican cambios significativos en la expresión de CD6 entre las diferentes células T vírgenes tras la estratificación de acuerdo a los haplotipos formados por dos SNPs no-sinónimos en el exón 4 (segundo dominio SRCR). Por lo tanto, el estudio sugiere que la variación funcional en CD6 podría contribuir en los estadíos tempranos de la inmunidad mediada por células.ATEROMA ASOCIADO A INFARTO CEREBRALLos eventos cerebrovasculares como el infarto o la isquemia cerebral, que son una de las mayores causas de muerte en el mundo, son frecuentemente el resultado de la ruptura de placas ateroscleróticas cuyo resultado es fatal o bien conlleva severas complicaciones. Estas placas se forman por una acumulación progresiva y modificación lípidos y material fibroso que producen inflamación y muerte celular. Según estudios epidemiológicos, el infarto cerebral es la tercera causa de muerte en los países occidentales, mientras que en España, las enfermedades cerebrovasculares representan la segunda causa de muerte. La medida del grosor intima-media de la carótida (CIMT) y la estenosis carotídea se han usado como marcadores para predecir el riesgo de desarrollar infarto cerebral. La CIMT también se correlaciona con factores como los niveles de HDL y triglicéridos, presión sanguínea, índice de masa corporal y el tabaco, factores que influyen en la progresión de lesiones ateromatosas. El engrosamiento de la intima-media y la progresión de las lesiones ocurren debido a un aumento de proliferación de células endoteliales, células del músculo liso, niveles aumentados de lipoproteínas, reclutamiento de monocitos y fuerzas de cizallamiento. Varios factores influyen en la inestabilidad de la placa, la cual puede conducir a su disociación de la arteria carótida causando síntomas clínicos (isquemia e infarto). Los factores asociados con la formación de placas inestables incluyen determinantes morfológicos como el contenido de colágeno en la capa fibrosa, la expresión de factores de tejido, el tamaño de los macrófagos y las células musculares lisas, y la inflamación. La lesión avanzada, que posee un alto riesgo de ruptura, se caracteriza histopatológicamente por una acumulación de células espumosas, una mayor cantidad de lípidos extracelulares en el núcleo y una capa fibrosa fina formada por células musculares lisas, células inmunitarias (células T, células dendríticas y mastocitos) y una matriz rica en colágeno.A nivel molecular los procesos implicados en la ruptura de la placa están todavía en estudio. Varios trabajos han identificado marcadores genéticos que están diferencialmente expresados en las placas asociadas a infarto comparadas con aquéllas que no dieron lugar a complicaciones clínicas. Estos factores incluyen citokinas, metaloproteasas, factores implicados en la hipoxia, el estrés de retículo endoplasmático y moléculas de superficie de las células endoteliales (moléculas de adhesión). La identificación de marcadores que predicen la vulnerabilidad en las lesiones ateroscleróticas contribuiría al desarrollo de tratamientos que podrían ayudar a reducir la presencia de complicaciones como el infarto cerebral. Nuestro estudio tuvo por objetivo identificar marcadores que se encontraran diferencialmente expresados en las placas de ateroma de la arteria carótida extraídas de pacientes con o sin complicaciones clínicas. Sesenta genes, incluyendo marcadores previamente establecidos (n=10), marcadores implicados en la inflamación (n=10) y marcadores implicados en el estrés de retículo endoplasmático (n=40) fueron estudiados en busca de expresión diferencial utilizando RNA de placas ateromatosas de la arteria carótida de 35 pacientes asintomáticos y 45 pacientes que desarrollaron infarto. El cDNA obtenido por retrotranscripción fue utilizado para el estudio de la expresión de mRNA mediante SYBR green. Los valores Ct observados fueron analizados mediante el método 2-dCt , y las diferencias de expresión se representaron como ¿fold changes¿.En este estudio, diez genes mostraron un incremento en la expresión de 1,5 veces, mientras que ocho genes mostraron una reducción en la expresión de al menos 1,5 veces. Los marcadores con expresión diferencial incluyen ITPR1 (FC = 2.8), TIMP1 (FC = 2.3), HMOX1 (FC = 2.1), PDIA4 (FC = 2.03), CD163 (FC = 1.8), IL12A (FC = 1.7), IL12B (FC = 1.6), PARK2 (FC = 1.53), IL-6 (FC = 1.48) and TRA1/GRP94 (FC = 1.49), FLJ32115 / ERp27 (FC = ¿4), LMAN (FC = ¿2), SEC63 (FC = ¿1.7) y ERO1LB (FC = ¿1.63). Mientras que unos pocos genes identificados en este estudio confirman resultados publicados anteriormente, también hemos identificado marcadores que no se conocían previamente. Usando el test de correlación de Spearman también identificamos marcadores que podrían estar positiva o negativamente correlacionados con otros marcadores. Estos incluyen macadores como PDIA4 y TIMP1 (¿ = 0.32, P = 0.02); LMAN1 y TIMP1 (¿ = ¿0.31, P = 0.02); PDIA4 y IL-12B (¿ = ¿0.26, P = 0.05); LMAN1 y PDIA4 (¿ = ¿0.26, P = 0.05); IL-12B y IL-6 (¿ = 0.29, P = 0.01); IL-6 y PARK2 (¿ = 0.51, P = 0.000005), y FLJ32115 y SEC63 (¿ = 0.31, P = 0.01). Por lo tanto, el presente estudio identifica marcadores que están diferencialmente expresados en las placas carotídeas inestables, indicando el papel de la maquinaria de plegamiento de proteínas del retículo endoplasmático, la hipoxia y la inflamación en la ruptura de las placas ateroscleróticas que conduce al infarto.