Aislamiento e identificación de proteínas intracelulares que interaccionan con endostatina

Abstract

La endostatina (ES) es un inhibidor endógeno de la angiogénesis generado por proteólisis del extremo C-terminal del colágeno ¿1XVIII. Esta proteína tiene un gran interés terapéutico debido a su potente actividad como fármaco antiangiogénico y antitumoral, sin que ocasione toxicidad ni resistencia adquirida posterior al tratamiento. Debido a la inestabilidad y corta vida media en circulación de la ES recombinante (rhES) de grado clínico, ésta no ha continuado utilizándose de manera generalizada como fármaco.Para el desarrollo de nuevas terapias antitumorales basadas en este inhibidor, es necesario conocer cuál essu mecanismo de acción, el cual aún no ha sido establecido a pesar de los numerosos estudios de funcionalidad que han sido llevados a cabo con la ES y de haberse identificado una gran cantidad de ligandos para esta proteína. En este trabajo se ha abordado la búsqueda de proteínas intracelulares con las que la rhES es capaz de interaccionar y formar potenciales complejos para llevar a cabo su función, mediante ensayos de afinidad a derivados de rhES utilizando extractos celulares de distintas líneas celulares tumorales. Con este objetivo, se han utilizado como matrices de afinidad distintos soportes funcionalizados con rhES obtenidos mediante técnicas de inmovilización covalente y multipuntual de proteínas a soportes activados de agarosa y nanopartículas magnéticas sintetizadas en el laboratorio. En los distintos derivados de rhES obtenidos, la proteína adopta orientaciones determinadas dependiendo del tipo de aminoácidos que se utilicen para inmovilizar el polipéptido, según el tipo de estrategia de inmovilización utilizada.El resultado de estos ensayos, junto con el estudio mediante modelización molecular y análisis estructural de los derivados, ha permitido determinar que el derivado glioxil-agarosa/rhES es el soporte más adecuado para su uso como matriz de afinidad en ensayos de aislamiento de potenciales ligandos de la rhES. Esto es debido a que en este soporte la proteína queda presumiblemente orientada con sus dominios activos expuestos al exterior y estéricamente accesibles para interaccionar con otras biomoléculas.Utilizando glioxil-agarosa/rhES, se ha conseguido aislar a partir de extractos celulares de la línea tumoral CT26, una serie de proteínas que directa o indirectamente interaccionan con rhES, destacando entre ellas la nucleolina y la tropomiosina-3, proteínas cuya interacción con ES ya ha sido descrita en otros tipos celulares y empleando otras metodologías. Entre las proteínas aisladas se ha identificado a la nucleofosmina como un potencial ligando de la rhES con la que in vivo podría formar complejos intracelulares implicados en el control que la ES ejerce sobre la proliferación y migración celular.