Population genetics of the European anchovy (engraulis encrasicolus, l) in the Bay of Biscay

Resumen

En la última década, la aplicación de la información genética en especies marines explotadas ha mejorado nuestro conocimiento sobre los patrones de abundancia y distribución de las especies, y ha revolucionado conceptualmente las teorías ecológicas y evolutivas (Hauser y Seeb, 2008). Actualmente, las aplicaciones de los marcadores genéticos en las especies marinas explotadas incluyen el estudio de la estructura genética de las poblaciones, sostenibilidad y conservación, y trazabilidad (Waples y Naish, 2009).Esta tesis doctoral se centra en la evaluación de las tres disciplinas previamente mencionadas en la anchoa Europea (Engraulis encrasicolus), particularmente en la región del Golfo de Bizkaia. La anchoa Europea es un pequeño pez pelágico que se encuentra ampliamente distribuido a lo largo del Océano Atlántico, el Mar mediterráneo y el Mar Negro; además, esta especie tiene gran importancia socio-económica. En esta tesis doctoral se descubren miles de marcadores SNP en el transcriptoma de anchoa Europea mediante tecnologías de secuenciación de siguiente generación (NGS), y una fracción de estos marcadores (cientos de ellos) fue posteriormente validada. Tras ello, se llevaron a cabo los objetivos de la presente tesis doctoral: (1) evaluar la estructura genética poblacional de anchoa en el Golfo de Bizkaia, (2) estimar el tamaño efectivo de la población en el Golfo de Bizkaia, y, finalmente, (3) generar una herramienta genética para trazabilidad de las poblaciones comercialmente más importantes de esta especie.Descubrimiento de marcadores SNP en el transcriptoma de anchoa EuropeaRecientemente, las tecnologías NGS han sido consideradas un método rentable para generar una gran cantidad de valiosa información genómica de manera rápida (Metzker, 2010) y para descubrir marcadores genéticos tipo SNP en especies no modelo (Helyar et al., 2011), es decir, especies sin información genómica disponible. Las tecnologías NGS han aumentado el rendimiento y reducido los costes y el tiempo que previamente suponía el desarrollo de marcadores SNP, lo cual ha hecho posible la implementación de los marcadores SNP como marcadores genéticos estándar en especies no modelo (Kumar et al., 2012).El avance en los estudios genéticos en la anchoa Europea, una especie no modelo, había llegado a su cumbre hasta el desarrollo de las tecnologías NGS porque el número de marcadores genéticos desarrollados hasta la fecha en la especie era escaso hasta la fecha. Un nuevo proyecto de descubrimiento de marcadores genéticos sería muy provechoso para emplear estos marcadores en próximos estudios en esta especie.En esta tesis doctoral, se descubrieron y validaron nuevos marcadores SNP en el transcriptoma de anchoa Europea. Con este fin, se secuenció tanto el genoma como el transcriptoma de 10 individuos de anchoa Europea mediante las tecnologías NGS Illumina HiSeq2000 y Roche 454 GS-FLX Titanium, respectivamente. Se ensamblaron un total de 19.367 contigs de alta confianza (sin regiones duplicadas ni regiones de baja complejidad) en los que, combinando la información del genoma y el transcriptoma, se descubrieron 18.9942marcadores SNP. De estos, 2.317 marcadores SNP resultaron aptos para la validación. Se validaron 530 marcadores SNP mediante la plataforma de genotipado TaqMan® Open Array en 180 muestras pertenecientes a 5 poblaciones genéticamente diferenciadas, de acuerdo con los resultados propuestos por Zarraonaindia et al. (2012). Los ratios de conversión y validación fueron los mayores obtenidos hasta la fecha en una especie no modelo (91,3% y 83,2%, respectivamente). Este hecho se debe, en parte, a que hemos evitado de manera novedosa y exitosa las uniones intron-exon y las regiones repetidas del genoma durante el descubrimiento de marcadores SNP.Este capítulo de la presente tesis doctoral representa una estrategia prometedora para el descubrimiento de marcadores SNP en el transcriptoma de especies no modelo. Hemos generado un recurso genómica para la anchoa Europea. Estas secuencias y los nuevos e informativos marcadores SNP serán empleados para la investigación en esta especie en estudios sobre su estructura genética o estudios de adaptación, genética de la conservación y trazabilidad.Estructura genética poblacional y adaptación local en la anchoa Europea del Golfo de BizkaiaUna de las aplicaciones más importantes de la genética marina es la definición de stocks en base a la estructura genética poblacional. El concepto de stock o población es esencial para el estudio de especies explotadas, pues constituye la unidad básica para la gestión y para el estudio de dinámica de poblaciones de estas especies.La estructura genética poblacional de la anchoa Europea se ha estudiado durante muchos años mediante gran variedad de marcadores genéticos en numerosos estudios, pero con muestras geográficamente limitadas (Sanz et al., 2008; Kristoffersen y Magoulas, 2008; Zarraonaindia et al., 2009, 2012; Borrell et al., 2012; Viñas et al., 2013; Silva et al., 2014). En concreto, estudios previos realizados con marcadores moleculares (alozimas, microsatélites y marcadores SNP) (Sanz et al., 2008; Zarraonaindia et al., 2009, 2012), así como otros métodos no genéticos (microquímica de otolitos) (Aldanondo et al., 2010) han sugerido heterogeneidad genética en el Golfo de Bizkaia.En esta tesis doctoral se estudia la estructura genética poblacional de anchoa Europea en una muestra de 851 individuos abarcando un amplio rango de la distribución de la especie mediante 482 marcadores SNP: 481 SNP del transcriptoma previamente descubiertos mediante tecnologías NGS (Montes et al., 2013) y el SNP KLN-470-403 descrito por Molecular Ecology Resources Primer Development Consortium et al. (2012). Estos marcadores han resuelto los profundos niveles de estructuración genética poblacional en el Golfo de Bizkaia y se han empleados para estudiar patrones de adaptación local.Así, en este capítulo, se descubrieron dos poblaciones de anchoa Europea en el Golfo de Bizkaia: una población mayoritaria de plataforma ancha asociada a regiones oceánicas, y una población minoritaria de plataforma estrecha confinada a plumas de estuarios. Esta última población comprende un grupo genéticamente homogéneo presente en, al menos, dos estuarios del Golfo de Bizkaia (Abra y Garona), pero también está presente en un estuario de Holanda; por ello, representa una población que, a pesar de estar limitada a estuarios, se encuentra altamente conectada desde el Golfo de Bizkaia hasta latitudes mayores como3Holanda. En el Golfo de Bizkaia se estudiaron los patrones de adaptación local y se detectó una fuerte asociación entre las frecuencias alélicas de cada población con la salinidad. En total, se identificaron 11 genes involucrados en procesos metabólicos o del desarrollo que se encontraban en selección natural diversificadora entre ambas poblaciones del Golfo de Bizkaia. Los altos niveles de diferenciación genética observada entre ambas poblaciones, junto con evidencias de que conviven y se reproducen en el mismo lugar y en el mismo momento indican una barrera a la reproducción no física, lo cual podría ser reflejo de un proceso temprano de especiación ecológica.Sostenibilidad y genética de la conservación de la anchoa Europea en el Golfo de BizkaiaLa sostenibilidad y la conservación genética de las poblaciones naturales evalúan el grado de variabilidad genética dentro de las mismas. El estudio de la conservación genética proporciona información relevante sobre la salud genética de una población y ayuda a evaluar su riesgo de colapso o extinción y su grado de sensibilidad o capacidad de recuperación. En la actualidad existen diversos estudios que sugieren que un alto tamaño censal (Nc) de las poblaciones marinas es engañoso, pues el tamaño efectivo poblacional (Ne) estimado para algunas especies es extremadamente bajo (Hauser y Carvalho, 2008). Las reducciones en el tamaño efectivo poblacional (Ne) pueden llegar a significar una pérdida de diversidad genética y, por tanto, limitación de la capacidad adaptativa de la población a las distintas perturbaciones.La anchoa Europea es uno de los más importantes recursos pesqueros en muchas zonas, donde grandes poblaciones soportan grande pesquerías, algunas de las cuales han sufrido episodios de colapso. El colapso más reciente de una pesquería de esta especie es el de la pesquería del golfo de Bizkaia. La sobreexplotada población de anchoa de esta región comenzó a disminuir en 2002 y, debido a una serie de malos años para el reclutamiento, colapsó en 2005, año en el que se cerró temporalmente la pesquería y no se recuperó hasta 2010 (ICES, 2010; ICES, 2011), cuando se reabrió. La lenta recuperación de esta población llevó a los ecólogos a cuestionarse la sostenibilidad de la población de anchoa del Golfo de Bizkaia. Desde un punto de vista de la conservación de esta población es necesario estudiar si los cambios en Nc también se reflejan en Ne, pues de ser así, la sobreexplotación de esta pesquería habría podido causar una pérdida de diversidad de la población con la consecuente pérdida de capacidad de respuesta y, probablemente, colapso final. En el tercer capítulo de esta tesis se estudian los cambios en Ne a lo largo de 19 generaciones y se relacionan con los cambios en Nc con objeto de evaluar los límites seguros de la población desde un punto de vista genético y saber si la recuperación de la población ha sido frenada por una reducción en la diversidad o por otros motivos.Se estudiaron 357 marcadores SNP neutrales y que cumplían el equilibrio de Hardy-Weinberg en una muestra temporal (1993-2012) de 338 individuos del Golfo de Bizkaia. En este estudio detectamos que la diversidad genética se ha mantenido estable durante décadas, pues no se observaron cambios en las estimas de Ne antes, durante y después del colapso pesquero ni tampoco se ha detectado un efecto cuello de botella. El ratio Ne/Nc de la población mayoritaria de anchoa Europea en el Golfo de Bizkaia se encuentra en el rango de 10-5-10-7y es4similar al de otras especies de peces marinos previamente estudiados (ver revisión de Hauser y Carvalho, 2008). A pesar de la gran presión pesquera ejercida sobre la población mayoritaria del Golfo de Bizkaia, las altas estimas de Ne sugieren que la lenta recuperación de la de anchoa de esta región no se debió a la pérdida de su potencial adaptativo, sino, probablemente, a una serie de años de malas circunstancias ambientales para una buena supervivencia de los estadios tempranos (huevo, larva y juvenil) o de periodos y tiempos demasiado cortos para el reclutamiento.Trazabilidad del origen geográfico de anchoa Europea en base a marcadores genéticosActualmente, la sobreexplotación pesquera afecta a numerosas poblaciones de peces marinos comercialmente importantes a lo largo del mundo. La pesca ilegal, no declarada y no regulada (IUU, Illegal, Unreported and Unregulated) ha jugado un papel importante para esta sobreexplotación, pues constituye el 20% de las capturas globales (Agnew et al., 2009; Flothmann et al., 2010). Por ello, se han establecido leyes internacionales para regular las pesquerías y para mantener la sostenibilidad de las poblaciones que requieren certificados de captura con la información sobre el nombre científico de la especie, el método de producción (pesca o acuicultura) y el origen de todo el pescado consumido en la Unión Europea (Regulación de la UE número 1379/2013).La anchoa del Golfo de Bizkaia, también denominada ¿Anchoa del Cantábrico¿ es altamente apreciada por el consumidor, lo cual, de acuerdo con la ley de la oferta y la demanda, provoca que su precio sea mayor al de anchoa de otras regiones. Este producto ha sido víctima del fraude comercial debido a la sustitución del mismo por anchoa más barata (mayoritariamente anchoa del Golfo de Cádiz o del Noroeste del Mediterráneo). Estos hechos ponen de manifiesto la necesidad de proteger la ¿Anchoa del Cantábrico¿.La identificación del origen poblacional es especialmente complicada debido a que no existen diferencias morfológicas entre poblaciones de la misma especie, aunque sí genéticas. Por ello, en este tipo de estudios las técnicas moleculares y químicas son herramientas muy valiosas que aseguran el origen de los productos derivados de la pesca, incluso a pesar de estar fileteados o procesados (Filonzi et al., 2010; Miller y Mariani, 2010; Garcia-Vazquez et al., 2011; Miller et al., 2011; Ardura et al., 2013; Galimberti et al., 2013; Maralit et al., 2013; Marin et al., 2013). Hasta la fecha, han sido muy pocos los estudios genéticos que se han centrado en la trazabilidad de la anchoa Europea, y la mayoría de ellos se han dedicado a diferenciar entre las especies de anchoa (Santaclara et al., 2006; Jérôme et al., 2008; Rea et al., 2009). Sin embargo, recientemente, la Universidad del País Vasco (UPV/EHU) y el centro tecnológico AZTI-Tecnalia publicaron una patente para la identificación del origen geográfico de anchoa europea (Patente número ES 2 392 610 B1). Esta herramienta conseguía la identificación del 53% de individuos del Golfo de Bizkaia con una confianza del 94,4% mediante el genotipado de 18 marcadores SNP. Esta baja confianza de asignación se repitió también para la asignación de otros orígenes como el Noroeste del Mediterráneo (56,5% de los individuos asignados con una confianza del 96,7%) y el Atlántico Este (81,5% de los individuos asignados con una confianza del 98,4%). Los marcadores SNP derivados del transcriptoma previamente descubiertos serán empleados en este capítulo para mejorar esta herramienta de trazabilidad mediante el diseño5de un panel con el mínimo número de marcadores SNP necesarios para obtener un máximo poder de asignación de los individuos a su población de origen.El panel de trazabilidad se diseñó en base a las diferencias en las frecuencias alélicas de los marcodaroes SNP del transcriptoma de anchoa Europea entre 378 individuos del Golfo de Bizkaia, 28 individuos del Noroeste del Mediterráneo, y 96 individuos del Golfo de Cádiz. El panel diseñado consta de 16 marcadores SNP: 2 marcadores para la identificación de especie (descritos en la Patente número ES 2 392 610 B1) y 14 marcadores para la asignación del origne poblacional. Los 14 marcadores SNP consiguen, con un 100% de confianza, asignar el 70% de los individuos del Golfo de Bizkaia, el 57% de los individuos del Noroeste del Mediterráneo, y el 68% de los individuos del Golfo de Cádiz. Esta herramienta de trazabilidad consigue mejorar la anterior tanto en número de SNPs como en poder de asignación.