Entomología moleculardiversidad y filogenia de dípteros de interés médico-legal y veterinario, y su aplicación en situaciones reales

Resumen

El prerrequisito crítico en entomología médico-legal y veterinaria es la rápida y precisa identificación de la entomofauna recogida para estimar el periodo de actividad de los insectos (PAI), que se aproxima al intervalo post-mortem (IPM). La aplicación principal del análisis molecular es el diagnóstico inequívoco de insectos a nivel de especie, si bien, en determinadas situaciones los insectos presentan también un gran interés como reservorio de ADN de la fuente de alimento. En este contexto, el presente estudio explora la ciencia entomológica desde un punto de vista molecular, tratando aspectos clave en las investigaciones forenses.A día de hoy, la metodología de referencia para el análisis molecular combina amplificación y secuenciación de ADN. Por ello, inicialmente el trabajo se centró en evaluar la idoneidad, eficacia y precisión de los análisis con marcadores mitocondriales y nucleares en dípteros de interés médico-legal y veterinario del centro y sur de Europa. Con este fin, examinamos marcadores de ADNmt [COI barcode (658 pb), COI (616 pb), COII (725-731 pb), Cyt-b (307 pb) y Cyt-b-ARNtser-ND1 (495-496 pb)] y ADNnu [ITS2 (310-352 pb) e ITS12 (1081-1083 pb)] en las familias Calliphoridae (Chrysomya albiceps, Phormia regina, Calliphora vicina, C. vomitoria, Lucilia sericata, L. richardsi, L. ampullacea, L. silvarum, L. caesar, L. illustris y L. bufonivora), Muscidae (Musca autumnalis) y Oestridae (Hypoderma bovis). La mayoría de los Calliphoridae estudiados se utilizan habitualmente como indicadores en el centro y sur de Europa. En general, COI 616 pb y Cyt-b destacaron como herramientas diagnósticas entre los loci mitocondriales. Sin embargo, únicamente la región nuclear ITS2 permitió la diferenciación consistente incluso entre las especies de los géneros más complejos. Por su parte, el análisis del marcador COI barcode hizo posible confirmar la presencia de L. bufonivora en la Comunidad Autónoma del País Vasco (CAPV), así como de M. autumnalis en el sur de la misma (Álava). Globalmente, esta investigación resulta de incuestionable valor considerando la escasez de datos genéticos sobre las especies de interés médico-legal y veterinario en el sur de Europa. Asimismo, uno de los retos de la biología molecular moderna es el desarrollo e integración de nuevas tecnologías que mejoren las prestaciones de las convencionales. El análisis HRM es un método robusto que ofrece un considerable ahorro de tiempo y costes. Por este motivo, hemos desarrollado y validado un ensayo mediante el análisis HRM de la región ITS2 (HRM-ITS2), para el diagnóstico de califóridos de interés médico-legal y veterinario. Nos centramos, principalmente, en los dípteros necrófagos del sur de Europa más difíciles de identificar morfológicamente. Los resultados demostraron la robustez del análisis HRM-ITS2 en la diferenciación rápida y fiable de especies, en un único paso en tubo cerrado. De esta forma se reduce el riesgo de contaminación, aspecto esencial cuando se trabaja con evidencias forenses.En el ámbito médico-legal, la utilización de los insectos en estadios inmaduros como fuente de ADN del hospedador, se limita principalmente a situaciones simuladas y de difícil extrapolación. Por ello, nuestra meta fue recuperar y analizar, de forma efectiva, el ADN contenido en los buches de larvas procedentes de casos reales. La identificación individual humana se hizo con sistemas comerciales de amplificación de loci STRs, mientras que para el diagnóstico a nivel de especie se utilizó el locus Cyt-b. Los resultados demostraron que la calidad y cantidad de ADN extraído estaba relacionada con la apariencia y el tamaño de los buches. Los loci STRs amplificados coincidieron con los perfiles de referencia. La caracterización del marcador Cyt-b fue satisfactoria, incluso cuando el genotipado de loci STRs falló. Finalmente, tratamos de contribuir al desarrollo de la investigación forense en la CAPV con la revisión de un protocolo para la recogida, procesamiento y registro de evidencias entomológicas en formato bilingüe (Castellano y Euskera). // El prerrequisito crítico en entomología médico-legal y veterinaria es la rápida y precisa identificación de la entomofauna recogida para estimar el periodo de actividad de los insectos (PAI), que se aproxima al intervalo post-mortem (IPM). La aplicación principal del análisis molecular es el diagnóstico inequívoco de insectos a nivel de especie, si bien, en determinadas situaciones los insectos presentan también un gran interés como reservorio de ADN de la fuente de alimento. En este contexto, el presente estudio explora la ciencia entomológica desde un punto de vista molecular, tratando aspectos clave en las investigaciones forenses.A día de hoy, la metodología de referencia para el análisis molecular combina amplificación y secuenciación de ADN. Por ello, inicialmente el trabajo se centró en evaluar la idoneidad, eficacia y precisión de los análisis con marcadores mitocondriales y nucleares en dípteros de interés médico-legal y veterinario del centro y sur de Europa. Con este fin, examinamos marcadores de ADNmt [COI barcode (658 pb), COI (616 pb), COII (725-731 pb), Cyt-b (307 pb) y Cyt-b-ARNtser-ND1 (495-496 pb)] y ADNnu [ITS2 (310-352 pb) e ITS12 (1081-1083 pb)] en las familias Calliphoridae (Chrysomya albiceps, Phormia regina, Calliphora vicina, C. vomitoria, Lucilia sericata, L. richardsi, L. ampullacea, L. silvarum, L. caesar, L. illustris y L. bufonivora), Muscidae (Musca autumnalis) y Oestridae (Hypoderma bovis). La mayoría de los Calliphoridae estudiados se utilizan habitualmente como indicadores en el centro y sur de Europa. En general, COI 616 pb y Cyt-b destacaron como herramientas diagnósticas entre los loci mitocondriales. Sin embargo, únicamente la región nuclear ITS2 permitió la diferenciación consistente incluso entre las especies de los géneros más complejos. Por su parte, el análisis del marcador COI barcode hizo posible confirmar la presencia de L. bufonivora en la Comunidad Autónoma del País Vasco (CAPV), así como de M. autumnalis en el sur de la misma (Álava). Globalmente, esta investigación resulta de incuestionable valor considerando la escasez de datos genéticos sobre las especies de interés médico-legal y veterinario en el sur de Europa. Asimismo, uno de los retos de la biología molecular moderna es el desarrollo e integración de nuevas tecnologías que mejoren las prestaciones de las convencionales. El análisis HRM es un método robusto que ofrece un considerable ahorro de tiempo y costes. Por este motivo, hemos desarrollado y validado un ensayo mediante el análisis HRM de la región ITS2 (HRM-ITS2), para el diagnóstico de califóridos de interés médico-legal y veterinario. Nos centramos, principalmente, en los dípteros necrófagos del sur de Europa más difíciles de identificar morfológicamente. Los resultados demostraron la robustez del análisis HRM-ITS2 en la diferenciación rápida y fiable de especies, en un único paso en tubo cerrado. De esta forma se reduce el riesgo de contaminación, aspecto esencial cuando se trabaja con evidencias forenses.En el ámbito médico-legal, la utilización de los insectos en estadios inmaduros como fuente de ADN del hospedador, se limita principalmente a situaciones simuladas y de difícil extrapolación. Por ello, nuestra meta fue recuperar y analizar, de forma efectiva, el ADN contenido en los buches de larvas procedentes de casos reales. La identificación individual humana se hizo con sistemas comerciales de amplificación de loci STRs, mientras que para el diagnóstico a nivel de especie se utilizó el locus Cyt-b. Los resultados demostraron que la calidad y cantidad de ADN extraído estaba relacionada con la apariencia y el tamaño de los buches. Los loci STRs amplificados coincidieron con los perfiles de referencia. La caracterización del marcador Cyt-b fue satisfactoria, incluso cuando el genotipado de loci STRs falló. Finalmente, tratamos de contribuir al desarrollo de la investigación forense en la CAPV con la revisión de un protocolo para la recogida, procesamiento y registro de evidencias entomológicas en formato bilingüe (Castellano y Euskera).