The ptdins(3,4,5)p3 and ptdser dependent mechanism of pdk1 regulation in cancer cells. An in situ study by advanced quantitative imaging

Resumen

La señalización celular es esencial para la comunicación de las células con su entorno. La integridad ysupervivencia de un organismo pluricelular dependen directamente de su correcto funcionamiento.Enfermedades como el cáncer o la diabetes suelen tener su origen en la desregulación de algunas de estasrutas. PDK1 es un nodo central en señalización ya que regula un gran número de enzimas esenciales parael crecimiento, metabolismo, proliferación y supervivencia celulares. No obstante, la estructura cristalinacompleta de PDK1 no ha sido resuelta y, por tanto, el mecanismo detallado de su regulación en célulaspermanece incompleto.Hemos investigado, in situ, el papel de PtdIns(3,4,5)P3 y PtdSer en la regulación de la homodimerizaciónde PDK1 y de su sustrato PKB. Hemos desarrollado un método in situ para calcular la fracción dedonante involucrado en FRET resuelto en el tiempo. Este nuevo método nos ha permitido cuantificar demanera directa las poblaciones de homodímeros de PDK1 en función de su asociación con estosfosfolípidos aniónicos. Asimismo, hemos desarrollado un procedimiento automatizado de segmentaciónde imágenes para cuantificar distribuciones intracelulares de proteínas y lípidos en células intactas. Estemétodo, combinado con el uso de biosensores de fosfolípidos, nos ha permitido cuantificar distribucionesde PtdIns(3,4,5)P3 y PtdSer en células intactas. La homodimerización de PDK1 ha sido monitorizada conresolución espacial en sub-compartimentos de células individuales y con resolución temporal enrespuesta a la estimulación con factores de crecimiento. Además, hemos implementado FCS por barridopara medir la difusión de GFP-PHPDK1 recombinante en vesículas unilamelares gigantes dePtdIns(3,4,5)P3 y PtdSer. Hemos desarrollado un método de análisis para poder obtener los parámetros dedifusión de los datos brutos de FCS por barrido.En nuestro nuevo modelo para la regulación de PDK1 proponemos que las uniones a PtdSer y aPtdIns(3,4,5)P3 compiten por mantener a PDK1 en una conformación dimérica inactiva o activa,respectivamente. Al unir PtdIns(3,4,5)P3 el dímero inactivo cambia su conformación a la de un dímeroactivo que le permite disociarse de la membrana plasmática. En células con caminos de señalizacióndependientes de PI3K desregulados, PtdSer retiene a PDK1 en su conformación de dímero inactivo, esdecir, PtdSer es esencialmente un regulador negativo de PDK1. En células NIH3T3 ambos lípidoscompiten por unir PDK1 y son secuencialmente responsables de mantener a PDK1 en su conformaciónactiva.