Mass spectrometry-based proteomics strategies to define protein neddyltion

Abstract

Las modificaciones post-traduccionales reguladas por la ubiquitina y la familia de la ubiquitina estánimplicadas en diversas funciones vitales en las células eucariotas. Entre todas las proteínas de la familiade la ubiquitina, NEDD8 es la que comparte mayor similitud con la ubiquitina tanto en su secuenciacomo en su estructura. A pesar de esta similitud, NEDD8 tiene su propio conjunto de enzimas que resultaen una distinta cascada de conjugación. Las culinas, forman parte de la familia de ligasas de ubiquitinaCRLs (Culina-RING) y representan los sustratos mejor caracterizadas de NEDD8, por ello, la mayoría delos estudios sobre NEDDilación se han enfocado principalmente en la regulación y la degradación deproteínas ubiquitiladas. Recientemente, otros sustratos relevantes de NEDD8 han sido identificados locual sugiere que la NEDDilación está vinculada en muchos más procesos biológicos esenciales para lacélula. De hecho, NEDD8 responde a situaciones de estrés celular en comunicación cruzada con laubiquitina, sin embargo, todavía se desconoce el papel de la NEDDilación en respuesta al estrés. Laimportancia de la NEDDilación se ha sustentado gracias su inhibidor, MLN4924, usado exitosamente enel tratamiento de ciertos tipos de cáncer. En consecuencia, la identificación de nuevos sustratos deNEDD8 potencialmente ayudará a ampliar nuestra comprensión sobre los mecanismos por el cual suinhibición induce efectos anti-tumorales. No obstante, el conocimiento de las proteínas NEDDiladas estámuy limitado debido, en gran parte, a que las recientes técnicas en espectrometría de masa no permitendistinguir entre la NEDDylación y la ubiquitilación ya que ambas proteínas liberan la misma señal dobleglicina (GG) después de la digestión con tripsina del péptido modificado. En este trabajo nos enfocamosen el desarrollo de nuevas estrategias aplicadas en proteómica para resolver el problema que supone laidentificación a gran escala de las proteínas NEDDiladas. Con nuestros avances hemos logrado no solodistinguir sustratos específicos de NEDD8 sino también los sitios de modificación. Además, por mediode métodos de cuantificación en combinación con espectrometría de masas, hemos podido caracterizar elpapel de la NEDDilación en situaciones de conjugación canónica y atípica explorando así más allá de supapel homeostático como regulador de las CRLs.