Direct activation of metal oxide nanoparticlesapplication to biodistribution studies using positron emission tomography

Resumen

Durante la última década, la nanotecnología se ha convertido en una ciencia multidisciplinar con aplicaciones prometedoras en campos tan diversos como la biomedicina y la electrónica, entre otros. El desarrollo de técnicas para manipular y caracterizar materiales a escala nanométrica supone disponer de herramientas que nos permiten sintetizar y ensamblar un amplio abanico de nanomateriales controlando su composición, forma y tamaño para una gran diversidad de fines. La reducción de tamaño de un material a su análogo en escala nanométrica conlleva a un cambio en sus propiedades físico-químicas, las cuales se pueden modular controlando principalmente la forma y el tamaño durante el proceso de síntesis. La modificación de las propiedades de los materiales derivada de la reducción de escala ha provocado una masiva incorporación de nanomateriales en productos de consumo tales como embalajes de productos alimenticios, medicamentos, productos de higiene personal o cosméticos, entre otros. Un tipo de nanomateriales ampliamente utilizado en la industria son las nanopartículas de óxidos metálicos; por ejemplo, el óxido de titanio, el óxido de aluminio y el óxido de zinc se utilizan en una amplia variedad de productos industriales. Actualmente se conocen más de un millar de productos de uso cotidiano que incorporan en su composición este tipo de nanopartículas. El óxido de titanio presenta una elevada capacidad de absorción de la radiación ultravioleta, que lo convierte en un excelente candidato para la preparación de cremas solares ya que además de apantallar de forma eficaz las radiaciones dañinas es un compuesto relativamente económico. Refleja prácticamente la totalidad de la luz visible, siendo una de las sustancias más blancas existentes por lo que se incluye como pigmento blanco en pinturas, además de formularse en recubrimientos de comprimidos. El óxido de aluminio también se encuentra ampliamente implementado en muchas otras aplicaciones ya que su dureza y solidez lo sitúan al nivel del diamante como agente abrasivo. Se utiliza también en cosméticos como agente de relleno y en implantes dentales entre otros. El oxido de zinc se utiliza, por su capacidad bactericida, en productos de higiene personal como pasta de dientes. Además, se incorpora en formulaciones de productos cosméticos tales como las cremas solares, debido a su capacidad apantallante frente a la radiación ultravioleta tanto UV-A como UV-B. La creciente incorporación de los nanomateriales en productos de uso cotidiano y procesos industriales ha suscitado cierta preocupación en la comunidad científica relativa a los posibles riesgos que dichas nanopartículas pueden acarrear sobre la salud humana, derivados de la exposición a nivel ambiental o de usuario. Dicha preocupación se basa principalmente en dos evidencias: i) La actividad catalítica intrínseca de las nanopartículas puede producir alteraciones en diferentes vías de señalización metabólica y otros procesos intracelulares y ii) los iones liberados de las nanopartículas debido a su posible disolución in vivo pueden desequilibrar la catálisis enzimática mediada por iones. Estas interacciones no sólo dependen del tamaño y la forma de los nanomateriales, sino también de su composición, recubrimiento superficial y estado de agregación, así como de su capacidad de conjugación con otros componentes metabólicos como las proteínas, enzimas o lípidos. Por este motivo la nanotoxicología se ha convertido en un área de alto interés científico. En la actualidad hay muchos grupos de investigación que tratan de dilucidar la citotoxicidad de la nanopartículas de óxidos metálicos. En base a los estudios in vitro se ha demostrado, por ejemplo, que las nanopartículas de TiO2 internalizadas en la célula están confinadas en endosomas tardíos (orgánulos celulares que forman los lisosomas para degradar su contenido) y compartimentos caveolares (invaginaciones de la membrana plasmática utilizados por patógenos para evitar la degradación en los lisosomas), pero no presentan citotoxicidad en muchas líneas celulares. Por el contrario, las nanopartículas de ZnO presentan efectos citotóxicos, debido a que inducen proteínas pro-inflamatorias (citocinas), lisosomales y lesiones en mitocondria además de apoptosis, lo que se podría justificar por la liberación de Zn2+ al disolverse la nanopartícula. El escenario para evaluar los efectos tóxicos de las nanopartículas in vivo es bastante más complejo, ya que la detección de la presencia de nanopartículas una vez administradas/incorporadas a un organismo vivo es extremadamente compleja. Muchas de las técnicas utilizadas para detectar y cuantificar dichas nanopartículas son invasivas, y por lo tanto es posible utilizarlas en animales de experimentación pero no son trasladables al entorno humano. Además, muchas de las técnicas no se basan en la detección de las NPs en sí, sino en sus elementos constituyentes. En consecuencia, la presencia de elementos o compuestos endógenos puede ser interpretada (erróneamente) como una muestra de la presencia de NPs, llevando a conclusiones erróneas o sesgadas. Una alternativa a las técnicas invasivas son las técnicas de imagen, que permiten determinar las propiedades farmacocinéticas (y por lo tanto el perfil de biodistribución) de entidades químicas de un modo mínimamente invasivo. Dichas técnicas requieren la incorporación de un agente de contraste o ¿marcaje¿. La incorporación del marcaje permite la localización de las NPs mediante detección externa, utilizando las técnicas de imagen óptica (cuando el marcaje se realiza con un fluoróforo), tomografía por emisión de fotón único o SPECT (cuando el marcaje se efectúa con un isótopo emisor gamma) o tomografía por emisión de positrones o PET cuando el marcaje se lleva a cabo con un isótopo emisor de positrones. La imagen óptica, a pesar de resultar relativamente económica y accesible a un mayor número de investigadores, presenta ciertas limitaciones como son la baja resolución y el bajo poder de penetración de la luz visible o infrarroja, que restringe su aplicación a pequeños animales. Por otro lado, el marcaje con radioisotópos emisores de positrones o de rayos gamma es más apropiado, ya que la sensibilidad es mayor; además, la radiación gamma presenta una elevada capacidad de penetración en tejido, permitiendo una posible aplicación en animales grandes o incluso en humanos. Puesto que las técnicas PET y SPECT no ofrecen información anatómica, dichas técnicas se combinan con técnicas como la tomografía computarizada (CT) o la imagen por resonancia magnética (MRI) que pueden ofrecer imágenes anatómicas con elevada resolución y con excelente contraste en tejido duro (CT) o blando (MRI). Según lo descrito anteriormente, parece claro que las técnicas de imagen nuclear tales como PET o SPECT son óptimas para visualizar de modo no invasivo la localización de las NPs en organismos vivos. Sin embargo, la mayor dificultad en la aplicación de estas técnicas radica en la necesidad de incorporar en las NPs un isótopo radiactivo sin alterar significativamente las propiedades de la NP en cuestión. Hasta la fecha se han descrito varios métodos para realizar dicho marcaje, aunque muchos de ellos consisten en modificar la superficie de la NP con un agente marcado radiactivamente. Dado que el objetivo principal de esta tesis es el estudio de los perfiles de biodistribución de nanopartículas de óxidos metálicos que se formulan en productos comerciales, la decoración superficial se descartó inmediatamente ya que la funcionalización puede modificar sustancialmente las propiedades superficiales (y por tanto, el comportamiento biológico) de las NPs. En este contexto, se han diseñado, desarrollado e implementado estrategias para, utilizando reacciones nucleares in situ, activar NPs sin necesidad de modificar su composición superficial. Con las NPs marcadas se han efectuado estudios de biodistribución utilizando técnicas de imagen nuclear. Adicionalmente, y también dentro del contexto del proyecto HINAMOX (que ha financiado el trabajo realizado) se determinó el efecto inflamatorio producido por inhalación de NPs de ZnO en los pulmones, utilizando combinación técnicas de imagen nuclear y CT. En todos los casos, los estudios se efectuaros efectuaron en ratas. Inicialmente, y tal y como se describe en el capítulo 3, se desarrolló una estrategia para activar NPs comerciales de óxido de aluminio de diferentes tamaños nominales (10 nm, 40nm, 150 nm y 10 nm) mediante irradiación directa con protones para dilucidar como varían los patrones de biodistribución dependiendo del tamaño. El proceso de irradiación, llevado a cabo con un blanco sólido acoplado a un ciclotrón (acelerador de partículas), generó NPs marcadas con 13N mediante la reacción nuclear 16O(p,n)13N; las NPs obtenidas, en las cuales los átomos de 13N estaban insertados en el seno de la red cristalina del óxido metálico, presentaban una elevada actividad específica, incluso utilizando tiempos de irradiación cortos (unos minutos). El nitrógeno-13, a pesar de ser un radioisótopo con una vida media de 9,95 minutos, permitió estudiar el perfil de biodistribución (en rata) de las NPs tras administración intravenosa durante un periodo de 1 hora, utilizando un sistema de detección híbrido PET-CT. La adquisición de imágenes de CT permitió el dibujo manual de regiones de interés para los principales órganos. Dichas regiones de interés se trasladaron a las imágenes PET, con lo que pudo cuantificarse la distribución espacio-temporal de las NPs como porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido. La caracterización radiológica llevada a cabo mediante PET y espectroscopía gamma de baja resolución, mostraron que prácticamente toda la radiactividad generada durante el proceso de activación era debida a la presencia de 13N; asimismo, se detectaron trazas de 18F (0,2% aproximadamente), formado por la interacción de los protones incidentes con 18O, que se encuentra en una abundancia natural cercana al 0.2%. La caracterización efectuada antes y después del proceso de irradiación de las NPs mediante microscopía de transmisión electrónica (TEM), dispersión de luz dinámica (DLS) y medición de potencial zeta, mostraron que el proceso de irradiación directa no induce cambios significativos en el tamaño nominal promedio de las NPs ni en su potencial superficial. Es importante señalar que la determinación del patrón de biodistribución in vivo requiere también considerar la ruta de administración. Debido a que las nanopartículas de óxidos metálicos se encuentran más comúnmente en cosméticos y alimentos, es necesario entender su comportamiento cuando se administran por vía tópica, nasal y oral, ya que la piel, el tracto respiratorio y el tracto gastrointestinal están en continuo contacto con el medio exterior. Puesto que la absorción de las NPs administradas o incorporadas por dichas rutas es relativamente lenta, debe esperarse un tiempo de residencia de las NPs en el organismo relativamente largo, y en cualquier caso superior a 1 hora. Por este motivo, si bien el marcaje con 13N es una alternativa válida para determinar el patrón de biodistribución a tiempos muy cortos, era necesario explorar rutas de marcaje capaces de incorporar isótopos de vida media más larga que permitieran estudios de imagen más prolongados. Por este motivo, tal como se explone en el capítulo 4, se ensayó un proceso de síntesis basado en el método Stöber, para permitir la incorporación de oxígeno-18 en las NPs de óxido metálico. La hipótesis de trabajo se basaba en el hecho que, si se incorporaba eficientemente 18O en las NPs, su irradiación debería producir la generación de 18F mediante la reacción nuclear 18O(p,n)18F, que presenta una vida media sustancialmente más larga (109.7 min). Con esta finalidad, se ensayó el método de nanoprecipitación utilizando agua enriquecida ([18O]H2O) como disolvente, y se utilizó NH3(g) como base. Se ensayó la síntesis de NPs de Al2O3 y TiO2. A diferencia de lo que ocurre en el caso del Al2O3, en que el aluminio no se activa al ser irradiado con protones de E<18MeV, en el caso del [18O]TiO2 la irradiación con protones genera radioisótopos provenientes del metal. Por este motivo, se realizó una caracterización radiológica utilizando espectrometría gamma de alta resolución y mediante PET, adquiriendo imágenes dinámicas del material irradiado. Con la espectrometría de alta resolución se determinó la naturaleza de los radioisótopos presentes, mientras que la adquisición de imágenes PET permitió efectuar un ajuste multi-exponencial y determinar la cantidad de los diferentes isótopos emisores de positrones presentes en la muestra irradiada. Con las NPs activadas se ensayaros ensayaron las vías de administración siguientes: intravenosa, oral y dérmica. La vía oral y dérmica responden a la necesidad de conocer los patrones de biodistribución mediante la ingesta o paso transdérmico de las nanopartículas ya que son 2 de las principales vías de entrada de agentes externos al organismo. La vía intravenosa se estudió anticipando una posible aplicación de las NPs en el entorno biomédico. Al igual que ocurría en el trabajo descrito en el capítulo 3, se realizó una caracterización morfológica mediante TEM, DLS y difracción de rayos X antes y después del proceso de activación de las NPs, para controlar que tanto el tamaño como la fase cristalina de la nanopartícula no se veían afectados por el proceso de activación. El proceso de análisis de las imágenes obtenidas permitió observar que el proceso de marcaje es apto para monitorizar el patrón de biodistribución de las NPs hasta 8 horas tras la administración. Para la administración intravenosa, la mayor parte de las NPs se acumularon en el hígado ya a tiempos muy cortos, aunque se detectó la presencia de NPs en otros órganos mayores (hígado, pulmones, etc). En el caso de la administración oral, una gran parte de las NPs permanecía en el tracto gastrointestinal durante la duración del estudio, aunque se detectó una acumulación muy lenta y progresiva de radiactividad en otros órganos, como la vejiga. En el caso de la administración cutánea, la práctica totalidad de las NPs permanecieron en el lugar de administración durante todo el estudio, sugiriendo la necesidad de utilizar radiosótopos de vida media más larga. Por último, en el capítulo 5 se ha evaluado el potencial inflamatorio en los pulmones de nanopartículas de óxido de zinc. Esta parte del estudio atiende a la necesidad de conocer los riesgos potenciales que pueden sufrir trabajadores expuestos, en concreto la inflamación aguda producida por inhalación de nanopartículas. Con este fin, se administraron NPs no marcadas de óxido de zinc mediante una cámara de inhalación de exposición animal, evaluando el potencial inflamatorio en pulmones. Una vez administradas las nanopartículas, se realizaron estudios longitudinales PET, administrando [18F]FDG ([18F]2-deoxy-2-fluoro-D-glucosa; radiotrazador ampliamente usado en oncología) a tiempos 1, 7 y 28 días después de la administración de NPs de ZnO. La [18F]FDG queda atrapada en el interior celular debido al bloqueo metabólico que ocasiona el 18F en la posición 2 de la molécula de glucosa, haciendo que el proceso sea irreversible. En el caso de la inflamación, las células que retienen la [18F]FDG son los neutrófilos y los macrófagos infiltrados en los pulmones durante el proceso inflamatorio. Para cada punto temporal, se efectuaron adquisiciones dinámicas de 1 hora, y se cuantificó la cantidad de radiotrazador acumulado en el órgano diana; se determinó asimismo la concentración de radiotrazador en el torrente sanguíneo mediante un método basado en análisis de imagen, se aplicó un modelo cinético (análisis Patlak) para determinar la constante de influjo que describe el proceso inflamatorio. El análisis Patlak está basado en un modelo de compartimentos, suponiendo una parte del proceso reversible y otra irreversible, y utiliza regresiones lineales para analizar la cinética del trazador involucrado en la parte del proceso irreversible. Los resultados obtenidos se correlacionaron con estudios efectuados mediante inmunofluorescencia en tejido.