Evaluation of the toxicity of metal and metal bearing nanoparticles in aquatic organisms using zebrafish as model

Resumen

Evaluation of the toxicity of metal and metal bearing nanoparticles in aquatic organisms using zebrafish as model Tesis Doctoral. José M. Lacave Departamento de Zoología y Biología Celular Animal. Las nanopartículas (NPs) son un tipo de nanomateriales caracterizados por poseer al menos dos de sus dimensiones externas entre 1 y 100 nm. Aunque las NPs han estado presentes en la naturaleza desde siempre debido a erupciones volcánicas, incendios, etc., es durante las últimas décadas cuando se ha producido un incremento sustancial de la presencia de NPs manufacturadas. Estos materiales presentan una serie de propiedades físico-químicas, así como una reactividad química que las hacen sustancialmente diferentes de las mismas sustancias en forma masiva. Entre las NPs procesadas, las NPs metálicas y aquellas que contienen metales, incluyendo óxidos de metales, han causado un especial interés por el amplio abanico de aplicaciones en las que se pueden utilizar. En los últimos años se ha observado un incremento en el uso de NPs manufacturadas en productos de consumo diario, así como en procesos industriales, lo que da lugar a la generación de residuos que, directa o indirectamente, acaban en el medio acuático. Las características físico-químicas y el comportamiento de las NPs se pueden modificar una vez que éstas entran en el medio ambiente dependiendo de las características del medio receptor (pH, fuerza iónica, etc.), o verse afectadas por procesos de oxidación, disolución, etc. La presencia de NPs en los ecosistemas acuáticos puede provocar una gran variedad de efectos tóxicos en organismos, que a largo plazo podrían repercutir en la salud humana. La ruta de entrada de las NPs en los organismos depende de su hábitat. En peces, las NPs se adsorben directamente a la piel, escamas o aletas especialmente en aquellas zonas recubiertas de sustancias mucosas. También pueden entrar a través del sistema respiratorio, ya que las branquias de los peces están en constante contacto con las NPs presentes en la columna del agua. Otra ruta de entrada importante es a través de la dieta, ya sea por la ingesta de partículas suspendidas en el medio o por el consumo de organismos previamente expuestos a las NPs (biomagnificación a través de la cadena trófica). El pez cebra (Danio rerio) se ha erigido como organismo modelo para analizar el efecto tóxico que produce la exposición a NPs en organismos acuáticos, debido a las ventajas que presenta para su uso en el laboratorio: tamaño pequeño en edad adulta, fácil mantenimiento, facilidad de observación y manipulación, y la posibilidad de mantener un gran número de individuos en instalaciones relativamente pequeñas y económicas. Una hembra de pez cebra puede llegar a poner entre 200-300 huevos semanalmente. Los huevos son fertilizados externamente y tiene un desarrollo embrionario muy rápido (2-4 días). Además, hasta las primeras fases larvarias son transparentes, lo que permite la observación directa de cualquier alteración en el desarrollo sin necesidad de manipularlo. La hipótesis que se pretende demostrar en este trabajo es que la exposición a NPs metálicas (o que contienen metales) puede provocar efectos tóxicos en embriones de pez cebra y estos efectos varían dependiendo de las propiedades físico-químicas de las NPs y podrían diferir de los efectos provocados por otras formas del mismo metal. Además, la exposición a NPs a través de distintas rutas, puede provocar bioacumulación y efectos tóxicos en peces cebra adultos relacionados con el estrés oxidativo, la genotoxicidad o daños a diferentes niveles de organización biológica que se pueden analizar usando una batería de biomarcadores desde el nivel molecular hasta el nivel tisular. Para comprobar esta hipótesis se llevaron a cabo una serie de estudios que se describen en los capítulos que conforman la sección de Resultados y Discusión. En el Capítulo I, se realizó un estudio de la toxicidad aguda de una batería de NPs metálicas con diferentes características de composición química, tamaño, forma y presencia de aditivos y se comparó con la toxicidad las formas iónicas y masivas de los mismos metales, así como con la de los aditivos presentes en las soluciones. Para ello se utilizó el test de toxicidad aguda a 120 horas con embriones de pez cebra de acuerdo al protocolo estandarizado de la OECD (TG236) que es un método alternativo a la experimentación con animales. Se midió el efecto sobre la supervivencia, la eclosión (porcentaje y tiempo al que se produce), o la prevalencia de malformaciones. Se testearon cinco tipos de NPs: NPs de Ag cubiertas de maltosa de 20, 40 y 100 nm, NPs de Au estabilizadas con citrato de sodio de 5, 15 y 40 nm, NPs de CdS de ~4 nm, NPs de ZnO de <130 y <280 nm y NPs de SiO2 de 15, 30 y 70 nm. Además, se utilizaron NPs fluorescentes de SiO2 de 30 nm para estudiar la interacción entre las NPs con los embriones y el papel protector del corion durante las primeras horas de desarrollo. Las NPs solubles (Ag, CdS, ZnO) resultaron las más tóxicas, con valores de LC50 tan bajos como 0.529 mg Ag/L para las NPs de Ag de 20 nm y un incremento significativo de la prevalencia de malformaciones en embriones expuestos a 0.1 mg Cd/L de NPs de CdS. En el caso de las NPs insolubles, como el SiO2, no se observaron efectos agudos durante el desarrollo temprano del embrión debido al efecto protector del corion, aunque se podrían esperar efectos a más largo plazo ya que tras la eclosión se observaron NPs fluorescentes de SiO2 depositadas sobre las laminillas de la branquia y su excreción a través del intestino. En otros casos, como en el de las NPs de oro, la toxicidad se pudo atribuir a la presencia de aditivos (citrato de sodio) en la suspensión de las NPs, el cual provocó una toxicidad similar cuando se testeó por separado. En general, estos resultados indican que la toxicidad depende principalmente de la composición química y, por tanto, de la solubilidad de las NPs. Otras características, como el tamaño, juegan un papel secundario. Esta conclusión se basa también en la observación de que la forma iónica de los metales fue siempre más tóxica que la forma nano y la forma masiva fue la menos tóxica para el desarrollo embrionario del pez cebra. Una vez clasificadas las NPs atendiendo a su toxicidad, se seleccionaron dos de las más tóxicas (NPs de Ag de 20 nm y NPs de CdS) para evaluar su toxicidad sobre organismos adultos de pez cebra en comparación con la toxicidad de formas iónicas de los metales. Así en los Capítulos II y III se estudió el efecto de la exposición vía agua durante 21 días de peces cebra adultos a 10 ¿g Ag/L de NPs de Ag o a la misma concentración nominal de plata iónica. Tras la exposición, los peces se mantuvieron 6 meses en agua limpia para analizar los posibles efectos a largo plazo o la recuperación de los daños causados por la exposición. La acumulación de plata se midió a través de análisis químicos en el organismo completo y la acumulación de metales se detectó específicamente en el hígado y en el intestino por autometalografía. La microscopía electrónica de barrido de emisión de campo que se utilizó para analizar la presencia de plata en las branquias, hígado e intestino corroboró que estos órganos son dianas para la acumulación de plata. El destino subcelular de las NPs de Ag se determinó mediante microscopía electrónica de transmisión, detectándose en el citosol de las células epiteliales de las laminillas primarias de las branquias y en el núcleo y en las mitocondrias de los hepatocitos. Se utilizó una batería de biomarcadores para estudiar los efectos subletales provocados por la exposición a ambas formas del metal. En las condiciones ensayadas, no se encontró un efecto evidente en la estabilidad de la membrana de los lisosomas hepáticos, incremento del estrés oxidativo o genotoxicidad, aunque el análisis histopatológico mostró diversas alteraciones en las branquias. El análisis del transcriptoma completo del hígado mostró que la exposición por 3 días a NPs de Ag alteró significativamente (valor de p ajustado < 0.05) el nivel de transcripción de 219 transcriptos diferentes, mientras que la forma iónica reguló 410 transcriptos. Tras 21 días, se observó la tendencia contraria: la forma iónica reguló un menor número de transcriptos (291), mientras que el efecto de las NPs de Ag fue mucho más marcado, ya que se alteró el nivel de transcripción de 799 transcriptos diferentes. El análisis Blast2GO mostró que los distintos tratamientos enriquecieron de manera significativa los procesos metabólicos. Además, tras la exposición a las NPs de Ag también aparecieron especialmente enriquecidos los procesos relacionados con el sistema inmune o con procesos reproductivos. El análisis de correspondencia separó los cuatro tratamientos, siendo el factor ¿tiempo de exposición¿ el que explicaba la mayor parte de la variabilidad. El análisis funcional evidenció una alteración del metabolismo energético con la regulación significativa de la ¿glicolisis/gluconeogénesis¿ tras la exposición a la forma iónica (3 días) y a las NPs de Ag (21 días). Además, el ¿metabolismo del piruvato¿ y la ruta ¿biosíntesis de esteroides¿ se alteraron tras 3 días de exposición a la forma iónica y a las NPs de Ag, respectivamente. Otras rutas KEGG detectadas estaban relacionadas con el daño en el ADN (metabolismo de purinas y de pirimidinas) tras la exposición a plata iónica (3 días) y a NPs de Ag (3 y 21 días). En general, la exposición a ambas formas de plata alteró de manera significativa el transcriptoma hepático del pez cebra, siendo la respuesta a cada compuesto diferente dependiendo del tiempo de exposición. La plata iónica ejerció un efecto mayor en un tiempo de exposición más corto, mientras que las NPs de Ag afectaron tras una exposición más prolongada, pero también se detectaron efectos específicos tras la exposición a NPs de Ag, sugiriendo que la toxicidad de las NPs de Ag no estaría solo relacionada con la liberación de iones de plata, sino también con la forma nanoparticulada. En los Capítulos IV y V se estudió y comparó el efecto provocado en peces cebra adultos por la exposición vía agua a NPs de CdS y a cadmio iónico en las mismas condiciones que en el caso de las NPs de Ag (10 ¿g Cd/L durante 21 días y 6 meses en agua limpia). Se observó mortalidad alta en ambos grupos a partir del cuarto día de exposición y una acumulación significativa de cadmio tras 21 días de exposición. El análisis autometalográfico mostró un mayor número de depósitos negros de plata, indicando una mayor acumulación de metal, en el intestino que en el hígado. En el hígado, la mayor acumulación de metales se observó tras la exposición a cadmio iónico, lo cual puede explicar el mayor daño oxidativo a las proteínas evaluado como alteración de los niveles de ubiquitina libre y carbonilación de actina. Sin embargo, se registró una mayor desestabilización de la membrana lisosómica de los hepatocitos tras la exposición a las NPs de CdS. Mediante microscopía electrónica de transmisión, se detectaron NPs en el citoplasma de células epiteliales de la laminilla secundaria de las branquias, adheridas a la envoltura nuclear y dentro de pequeñas vesículas de la membrana de los hepatocitos. No se detectaron efectos genotóxicos en las condiciones testeadas. Se observó un incremento en la prevalencia de vacuolización en el hígado de animales expuestos y alteraciones histopatológicas relevantes en las branquias, como inflamación, aneurismas y fusión de las laminillas secundarias e hiperplasia de la laminilla primaria, indicando que las branquias son una de las principales entradas de cadmio en el organismo. El análisis completo del transcriptoma hepático reveló que las NPs de CdS regularon de manera significativa 15 y 4128 transcriptos diferentes tras 3 y 21 días de exposición, respectivamente, mientras que la forma iónica reguló 47 y 15802 transcriptos. El análisis de los términos GO mostró que procesos biológicos como la respuesta inmune o la homeostasis mitocondrial de los iones de calcio, componentes celulares como los filamentos intermedios o funciones moleculares tales como las uniones a actina se enriquecieron de manera significativa tras la exposición a cadmio iónico respecto de la exposición a NPs de CdS (test de Fisher). El análisis funcional no detectó rutas KEGG significativamente alteradas tras 3 días de exposición, pero sí tras 21 días. La exposición a NPs de CdS durante 21 días causó un efecto significativo en el sistema inmune y estrés oxidativo, mientras que tras la exposición a la forma iónica del cadmio alteró significativamente rutas relacionados con el daño y la reparación del ADN, así como con el metabolismo energético. El análisis de correspondencia separó los cuatro tratamientos, siendo el tiempo de exposición el factor que explicaba la mayor parte de la variabilidad. En resumen, ambas formas de cadmio ejercieron un fuerte efecto sobre el transcriptoma hepático del pez cebra tras una exposición a medio plazo, siendo los efectos provocados en el hígado del pez cebra diferentes dependiendo de la forma del cadmio a la que se les expone. Finalmente, en el Capítulo VI se testeó la toxicidad aguda de NPs de Ag de 5 nm cubiertas de poli N-vinil-2-pirrolidona y polietilenimina (PVP-PEI) en larvas de artemia (Artemia sp) y en embriones de pez cebra y se evaluó la bioacumulación y los efectos de la transferencia de plata a través de la dieta. Se registró acumulación de plata en artemias expuestas a 100 y 1000 ¿g/L de NPs de Ag durante 24 h. Basándonos en estos resultados, se expusieron artemias a dos concentraciones diferentes de NPs de Ag, 100 ng/L como una concentración ambientalmente relevante y 100 ¿g/L como una concentración potencialmente efectiva. Estas artemias se utilizaron para alimentar a los peces cebra durante 21 días simulando una cadena trófica simple de dos niveles. Para las larvas de artemia, los valores de EC50 obtenidos oscilaron entre 7.39 mg Ag/L (larvas de 48 h expuestas durante 48 h) y 19.63 mg Ag/L (larvas de 24 h expuestas durante 24 h), mientras que para los embriones de pez cebra el valor de LC50 a las 120 h fue de 0.052 mg Ag/L. Mediante autometalografía se observó que los peces cebra alimentados con artemias expuestas a NPs de Ag acumularon mayor cantidad de metal en el intestino que en el hígado, aunque en ambos órganos se observó el mismo patrón de acumulación de metal dependiente de la dosis y del tiempo. Tres días de dieta con artemias expuestas a 100 ng/L de NPs de Ag fue suficiente para alterar la salud general de los peces, según se reflejó en la reducción significativa del tiempo necesario para desestabilizar la membrana lisosómica y por la presencia de diversas histopatologías en el hígado. En general, los resultados de este trabajo mostraron que la exposición a NPs de Ag a través de la dieta fue capaz de provocar efectos tóxicos en el pez cebra, incluso a concentraciones ambientalmente relevantes, lo cual indica la necesidad de llevar a cabo estudios más detallados sobre el impacto real de los nanomateriales en el medio ambiente.