Actividades esfingomielinasa bacterianas y de mamíferos. Caracterización y efectos estructurales en membranas

Resumen

Las esfingomielinasas son un grupo de enzimas ampliamente distribuidas tanto en células eucariotas como procariotas, cuya función es hidrolizar el esfingolípido esfingomielina para obtener ceramida y fosforilcolina. En la actualidad, atendiendo a su pH óptimo y su origen, las esfingomielinasas se clasifican en varios grupos, a saber: enfingomielinasas ácidas, neutras dependientes de magnesio, neutras independientes de magnesio, alcalinas, de secreción, esfingomielinasas-fosfolipasas C bacterianas y las esfingomielinasas pertenecientes a las superfamilia de fosfolipasas C / fosfatasas. En el año 1986, el grupo de Shimon Gatt observó en eritrocitos de pollo un descenso en los niveles de esfingomielina cuando las células eran sometidas a un choque hipotónico. En 2004, el grupo de Florian Lang, mientras estudiaba la eriptosis, o muerte celular programada de los eritrocitos, vieron un aumento de niveles de ceramida tras un choque hipertónico. Uno de los objetivos de esta tesis doctoral ha sido el de caracterizar una actividad esfingomielinasa en eritrocitos humanos que se activa como consecuencia de un aumento en la energía de flexión, bien sea por un choque osmótico o por la inserción de moléculas en la monocapa externa de la membrana plasmática. Se ha observado que dicha actividad es inexistente en condiciones fisiológicas normales (medio isotónico) pero sin embargo, los niveles de esfingomielina descienden cuando la osmolaridad del medio cambia o se provoca un aumento en el área de la monocapa externa . Esto se ha comprobado por tres técnicas diferentes: cromatografía en capa fina, cromatografía líquida de alta resolución y espectrometría de masas. En el año 2000 el grupo de P.K. Kinnunen describió una actividad SMasa en lipoproteínas de baja densidad (LDL) humanas que podría estar relacionada con la formación de placas de ateroma. Los autores postularon que la proteína apo B-100, la única proteína de las lipoproteínas de baja densidad, era la responsable de la actividad SMasa. En esta tesis se utilizaron las técnicas de cromatografía en capa fina y HPLC con lípidos marcados fluorescentemente para caracterizar con más detalles la actividad descrita, sin embargo no se consiguió reproducir los resultados anteriormente expuestos. También se analizaron otro tipo de lipoproteínas, así como la influencia de iones Zn2+ o de detergentes tales como el Triton® X-100; sin embargo no se detectó ningún descenso en las cantidades de SM en las condiciones usadas. Los resultados expuestos aquí llevan a la conclusión de que la proteína apo B-100 no está relacionada con la actividad SMasa tal y como se propuso anteriormente. Por otro lado, se ha estudiado otro tipo de esfingomielinasa perteneciente a la superfamilia de fosfolipasas C / fosfatasas bacterianas, la fosfolipasa C HR2 (PlcHR2). Este enzima posee una actividad dual ya que hidroliza tanto el fosfolípido fosfatidilcolina como la esfingomielina, produciendo diacilglicerol, ceramida y fosforilcolina como productos finales. El objetivo de este estudio ha sido el de caracterizar la hidrólisis preferencial por un sustrato u otro, así como estudiar la existencia de otros posibles sustratos a parte de los anteriormente mencionados. Además, se ha descrito la actividad de un mutante de esta proteína (T178A) que contiene una mutación en el centro activo. Se ha descrito su actividad hidrolítica mediante la cuantificación de fosfatos, su capacidad de agregación midiendo la turbidez por espectrocopia, su actividad de liberación de contenidos y unión a membranas por espectrofluorescencia y monocapas.