Toxinas bacterianas con actividad fosfolipasa c/esfingomielinasa. Interacciones con bicapas lipídicas

Resumen

El objetivo general del proyecto es la compresión de los mecanismos moleculares subyacentes en la remodelación de membranas inducida por diversas toxinas bacterianas con actividad fosfolipasa o esfingomielinasa. El estudio se ha centrado en dos toxinas: - Esfingomielinasa de Bacillus cereus. - ¿-toxina de Clostridium perfringens. A.- Efecto de los alcanos, sobre membranas modelo, como vehículos de reactivos hidrofóbicos. Se ha observado que determinados lípidos son importantes reguladores metabólicos lo que ha motivado la realización de numerosos experimentos en los cuales se han añadido lípidos a las células con la intención de observar cambios metabólicos inducidos por estas moléculas. En el caso de moléculas hidrofóbicas, por ejemplo diacilgliceroles o ceramidas, éstas son resistentes a la dispersión. Una de las técnicas que se ha llevado a cabo para solubilizar estos lípidos ha sido la utilización de disolventes orgánicos como el octano o el dodecano. Estos disolventes se añaden en porcentajes muy pequeños (<1%) a las células en suspensión, esperándose la incorporación de los lípidos bioactivos en las membranas celulares. Experimentos en los que se observaron los efectos inhibitorios del dodecano en la permeabilización dependiente de ceramida producida por la esfingomielinasa de Bacillus cereus, motivaron nuevos experimentos para estudiar en mayor detalle los efectos estructurales de los alcanos sobre las membranas lipídicas. B.- Caracterización de la actividad catalítica de la ¿-toxina de Clostridium perfringens. La ¿-toxina de Clostridium perfringens es el principal factor de virulencia de la gangrena gaseosa producida por esta bacteria. La proteína es hemolítica, dermonecrótica y letal. Esta toxina es una fosfohidrolasa con una marcada preferencia por la fosfatidilcolina y esfingomielina, dos componentes mayoritarios de la hemimembrana externa de las células eucariotas. La alfa-toxina es una metaloenzima de cadena única, dependiente de zinc, formada por 370 aminoácidos. Su estructura tridimensional presenta dos dominios unidos por una corta región flexible. El dominio amino-terminal (residuos 1-246), consiste en nueve ¿-hélices altamente empaquetadas, y es donde reside la actividad catalítica. Presenta homología con la fosfolipasa C no letal de Bacillus cereus. El dominio carboxilo-terminal (residuos 256-370), consiste en ocho hojas ß antiparalelas que conforman un 'sándwich ß', y depende de calcio para interaccionar con los sustratos. Este dominio presenta homología estructural con los dominios C2 de unión a calcio presentes en proteínas eucariotas. La función de la ¿-toxina no sólo permite a la bacteria destruir la barrera de permeabilidad de las células del huésped para la obtención de nutrientes, sino que también le permite escapar del fagosoma al ser endocitada por los macrófagos del huésped, y liberarse al citosol. Como consecuencia de la actividad fosfolipasa y esfingomielinasa de la toxina, los productos de hidrólisis (diacilglicerol y ceramida), que son importantes segundos mensajeros de la célula, son liberados al citosol.