Exploring new labelling strategies for boronated compoundstowards fast development and efficient assessment of BNCT drug candidates

Resumen

La terapia por captura de neutrones (BNCT o Boron Neutron Capture Therapy), fue descrita por primera vez por Locher en 1936 y es una modalidad terap¿utica binaria para el tratamiento del c¿ncer que se basa en la captura de neutrones t¿rmicos por medio de ¿tomos de 10B, previamente acumulados en las c¿lulas tumorales. La captura del neutr¿n t¿rmico resulta en la formaci¿n de un n¿cleo de 11B, que fisiona para generar dos iones altamente energ¿ticos: 4He2+ y 7Li3+. El da¿o y la posterior muerte celular se producen por la ionizaci¿n que provocan estas part¿culas en su recorrido, antes de perder completamente su energ¿a. El desarrollo hist¿rico de la BNCT se ha centrado en el tratamiento de tumores cerebrales malignos, cuya extirpaci¿n resulta arriesgada y el tratamiento mediante t¿cnicas como la radioterapia o la quimioterapia provocan da¿os importantes en el tejido sano circundante. Se estima que se requieren aproximadamente entre 10 y 30 ¿g de 10B por gramo de tumor para obtener resultados terap¿uticos relevantes, aunque esta cantidad puede reducirse considerablemente si la acumulaci¿n se localiza cerca del n¿cleo celular. De lo expuesto anteriormente se deduce que resulta de elevada importancia el dise¿o de mol¿culas que posean un gran n¿mero de ¿tomos de 10B en su estructura y que presenten elevada afinidad/especificidad por las c¿lulas tumorales. Los heteroboranos poli¿dricos representan una estructura qu¿mica altamente recurrida para su aplicaci¿n en la BNCT. Este hecho se debe, por un lado, a la alta acumulaci¿n de ¿tomos de boro en una misma mol¿cula y, por otro lado, a su elevada versatilidad qu¿mica. Entre los heteroboranos poli¿dricos se encuentran los dicarba-closo-dodecaboranos (tambi¿n llamados carbaboranos o carboranos, de f¿rmula emp¿rica general C2B10H12), que presentan geometr¿a pr¿cticamente icosa¿drica, de modo que cada ¿tomo de carbono y/o boro est¿n hexacoordinados. Existen en las formas isom¿ricas orto, meta y para, que difieren entre s¿ en la posici¿n relativa de los ¿tomos de carbono del cl¿ster; sus caracter¿sticas f¿sico-qu¿micas m¿s relevantes son su elevada versatilidad y su elevada estabilidad t¿rmica y fotoqu¿mica en el rango UV-visible. Debido a estas caracter¿sticas ¿nicas, los carboranos se han utilizado hist¿ricamente para preparar catalizadores, pol¿meros, compuestos de coordinaci¿n y radiof¿rmacos, aunque una de sus principales aplicaciones radica en la preparaci¿n de compuestos aptos para su utilizaci¿n en la BNCT; durante las ¿ltimas d¿cadas, muchos grupos de investigaci¿n han desarrollado nuevas estructuras incorporando heteroboranos poli¿dricos en general y carboranos en particular con potencial aplicaci¿n en la BNCT. Una de las estrategias m¿s utilizadas consiste en incorporar una mol¿cula de orto-carborano a diferentes carbohidratos, ya que estos ¿ltimos presentan no s¿lo baja toxicidad, sino que poseen cierta afinidad hacia determinados receptores espec¿ficos que se encuentran en la superficie tumoral y compensan la elevada hidrofobicidad inherente al cl¿ster de carborano, que podr¿a provocar uni¿n inespec¿fica indeseada o acumulaci¿n en el h¿gado. Estrategias alternativas proponen la s¿ntesis de amino¿cidos, porfirinas, poliaminas, o nucle¿sidos (o derivados de ¿stos) que contienen carboranos como grupos sustituyentes, o de liposomas que contienen en su interior heteroboranos poli¿dricos que se liberan en los tumores aprovechando la vasculatura inmadura que se encuentra en las inmediaciones de los tumores que proliferan r¿pidamente. Estudios pre-cl¿nicos efectuados sobre algunos de los compuestos anteriormente citados han demostrado claramente la eficacia terap¿utica en muchos modelos tumorales (especialmente en tumores cerebrales), e incluso algunos ensayos cl¿nicos han demostrado que la BNCT puede implementarse de forma segura a nivel cl¿nico. Sin embargo, la eficacia terap¿utica s¿lo est¿ garantizada en el caso en que el f¿rmaco se encuentre en el interior de las c¿lulas tumorales y, a ser posible, cerca del n¿cleo. Es por lo tanto crucial disponer de una herramienta capaz de monitorizar el comportamiento fisiol¿gico y farmacol¿gico de los ¿tomos de 10B (o del f¿rmaco portador) dentro del paciente. Dicha herramienta deber¿a permitir (idealmente) determinar de manera no invasiva la concentraci¿n de 10B en tejido, sangre y orina, as¿ como la distribuci¿n espacial microsc¿pica a nivel celular y sub-celular. En la actualidad, la comunidad cient¿fica dispone de varios m¿todos que permiten determinar la concentraci¿n de 10B en muestras, tanto a nivel macrosc¿pico como microsc¿pico. Uno de los m¿s utilizados hist¿ricamente es la Espectroscopia de Rayos Gamma Prompt (PGRA) que permite medir el contenido medio de 10B en muestras macrosc¿picas. Otras t¿cnicas com¿nmente utilizadas (de forma aislada o en combinaci¿n con otras) son la Espectroscopia de Emisi¿n por Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP-EOS), Autorradiograf¿a Alfa de Alta Resoluci¿n, Radiograf¿a por Captura de Neutrones (NCR) y Espectroscop¿a Electr¿nica de P¿rdidas de Energ¿a (EELS). Todas las t¿cnicas citadas anteriormente tienen en com¿n que son invasivas (aunque no necesariamente destructivas) y que determinan directamente la cantidad de boro. Una alternativa a dichas t¿cnicas consiste en determinar la concentraci¿n de f¿rmaco portador de boro y no directamente la cantidad de 10B, y es en este escenario donde cobran importancia las t¿cnicas de imagen molecular, en especial las t¿cnicas nucleares de imagen, entre las que se encuentran la Tomograf¿a por Emisi¿n de Fot¿n ¿nico (SPECT) y la Tomograf¿a por Emisi¿n de Positrones (PET). Ambas t¿cnicas (PET y SPECT) permiten obtener im¿genes tridimensionales in vivo y a tiempo real, que ofrecen informaci¿n acerca de la distribuci¿n espacio-temporal de un radiotrazador administrado a un sujeto, siendo el radiotrazador cualquier especie qu¿mica marcada con un radiois¿topo emisor de fotones gamma (SPECT) o de positrones (PET). Durante los ¿ltimos a¿os las t¿cnicas nucleares se han postulado como una herramienta fundamental no s¿lo en el entorno diagn¿stico, sino tambi¿n para el estudio farmacocin¿tico y farmacodin¿mico de nuevas entidades qu¿micas. En el supuesto que se marcara isot¿picamente un f¿rmaco con potencial aplicaci¿n en la BNCT, las t¿cnicas de imagen nuclear permitir¿an conocer, en cada momento y para cada parte del organismo, la concentraci¿n de f¿rmaco una vez ¿ste se hubiera administrado a un sujeto. A pesar del potencial te¿rico que presentan las t¿cnicas de imagen nuclear, la principal dificultad en su aplicaci¿n radica en la necesidad de marcar radiactivamente todos y cada uno de los f¿rmacos potencialmente activos. Este hecho, unido al corto per¿odo de semidesintegraci¿n de los is¿topos m¿s com¿nmente empleados (que obliga a desarrollar procesos de marcaje r¿pidos, efectivos y automatizables) ha provocado que hasta la fecha tan s¿lo se haya marcado un candidato (L-para-boronofenilalanina, BPA) con Fl¿or-18 (is¿topo emisor de positrones). Los ensayos realizados con este compuesto (en los que se combina la PET con t¿cnicas de imagen anat¿micas, concretamente Tomograf¿a Computerizada o CT) permitieron determinar la farmacocin¿tica, el metabolismo y la acumulaci¿n en tejido del radiotrazador (18F-BPA). La acumulaci¿n del radiotrazador en tumor determinada mediante las t¿cnicas de imagen correspond¿a con la acumulaci¿n de f¿rmaco (BPA) determinada mediante t¿cnicas ex vivo. Es evidente, pues, que las t¿cnicas de imagen nuclear, especialmente la PET (que a diferencia de la SPECT permite una cuantificaci¿n absoluta de la distribuci¿n espacio-temporal del radiotrazador) pueden desarrollar un papel fundamental en el salto hacia la aplicaci¿n cl¿nica de la BNCT como modalidad terap¿utica rutinaria en el entorno hospitalario. Para ello es imprescindible, sin embargo, dise¿ar estrategias para la incorporaci¿n de is¿topos radiactivos (emisores de positrones o emisores gamma) a mol¿culas ricas en boro. Esta es precisamente la tem¿tica que se aborda en la presente tesis doctoral. En el cap¿tulo 4 se presentan dos estrategias diferentes para la incorporaci¿n de is¿topos radiactivos en carboranos funcionalizados. La primera estrategia se basa en la mono-[18F]fluoraci¿n del o-carborano mediante sustituci¿n nucleof¿lica, utilizando el ani¿n [18F]F- producido mediante irradiaci¿n de agua enriquecida en ox¿geno-18 con protones acelerados, y una sal de arilyodonio del carborano. Una vez producido el marcaje, se plantea la funcionalizaci¿n del carborano marcado radiactivamente mediante formaci¿n de la sal litiada y posterior reacci¿n con aldeh¿dos. La segunda estrategia se basa en la preparaci¿n de decaborano radio-yodado mediante intercambio isot¿pico, y subsiguiente reacci¿n con acetilenos sustituidos en acetonitrilo (que act¿a simult¿neamente como base de Lewis y como disolvente) bajo calentamiento con microondas, rindiendo derivados del o-carborano funcionalizados con diferentes sustituyentes. Ambas estrategias poseen un elevado valor sint¿tico ya que permiten la preparaci¿n de una amplia variedad de carboranos marcados radiactivamente. Fruto del trabajo expuesto en este cap¿tulo han resultado dos publicaciones cient¿ficas en revistas internacionales:1- Gona KB, G¿mez-Vallejo V, Padro D, Llop J; [18F]Fluorination of o-carborane via nucleophilic substitution: towards a versatile platform for the preparation of 18F-labelled BNCT drug candidates. Chemical Communications, 2013. 49(98): 11491-11493. 2- Gona KB, Lakshmi VPN Thota J, Baz Z, G¿mez-Vallejo V, Llop J, Straightforward synthesis of radioiodinated Cc-substituted o-carboranes: towards a versatile platform to enable in vivo assessment of BNCT drug candidates. Dalton Transactions. 2015. 44: 9915-9920. Actualmente se est¿ preparando una tercera publicaci¿n.En el cap¿tulo 5 se presentan estrategias para el marcaje de derivados del ani¿n cobalto-bis-dicarballuro (COSAN). Para ello, se utilizan reacciones de intercambio isot¿pico catalizadas por paladio utilizando dos is¿topos radiactivos: 125I (emisor gamma de baja energ¿a) y 124I (emisor de positrones). Los derivados marcados con 125I se utilizaron para determinar el patr¿n de biodistribuci¿n en roedores utilizando disecci¿n y contaje de ¿rganos, mientras que los an¿logos marcados con 124I se utilizaron para determinar el patr¿n de biodistribuci¿n mediante PET-CT, utilizando para ello tanto animales sanos como diferentes modelos tumorales. Cabe destacar que este trabajo se realiz¿ en estrecha colaboraci¿n con el grupo de investigaci¿n liderado por los Profesores Francesc Teixidor y Clara Vi¿as, del Institut de Ci¿ncia de Materials de Barcelona (ICMAB-CSIC). Dicho grupo de investigaci¿n llev¿ a cabo la s¿ntesis de los precursores para el marcaje y particip¿ activamente en el an¿lisis de los resultados obtenidos y presentados en este cap¿tulo. Fruto del trabajo realizado, ha resultado una publicaci¿n cient¿fica en una revista internacional: 3- Gona KB, Zaulet A, G¿mez-Vallejo V, Teixidor F, Llop J, Vi¿as C; COSAN as a molecular imaging platform: synthesis and ¿in vivo¿ imaging. Chemical Communications. 2014. 50: 11415-11417. Actualmente se est¿ preparando una segunda publicaci¿n.Los cap¿tulos 6 y 7 de esta tesis doctoral se han focalizado en la preparaci¿n de an¿logos de carboranos marcados con Carbono-11. En el cap¿tulo 6 se describe la preparaci¿n de dos an¿logos del 2-(4-aminofenil) benzotiazol en los que el anillo benc¿nico se sustituye por una unidad m-carborano. Posteriormente, se procede a la incorporaci¿n del is¿topo radiactivo mediante metilaci¿n. Para ello, se genera en primera instancia el precursor radiactivo [11C]CH3I, que es transformado en [11C]CH3OTf para llevar a cabo la correspondiente reacci¿n de metilaci¿n. Este trabajo result¿ en la publicaci¿n de un art¿culo cient¿fico:4- Gona KB, Lakshmi VPN Thota J, Baz Z, G¿mez-Vallejo V, Llop J, Synthesis and 11C-radiolabelling of 2-carboranyl benzothiazoles. Molecules. 2015. 20: 7495-7508.Por ¿ltimo, en el cap¿tulo 7 se describe un m¿todo novedoso para la preparaci¿n de amidas en un solo paso, mediante carbonilaci¿n catal¿tica de 1-iodo-1,7-dicarba-closo-dodecaborano utilizando mon¿xido de carbono. Esta reacci¿n, si bien no se ha ensayado en condiciones de radiactividad, ser¿a f¿cilmente trasladable a la preparaci¿n de compuestos marcados con carbono-11, ya que el [11C]CO es un sint¿n ampliamente utilizado en el contexto de la radioqu¿mica. Con el fin de proceder en un futuro a la preparaci¿n de amidas marcadas radiactivamente incorporando un cl¿ster de carborano, en el contexto de esta tesis doctoral se ha puesto a punto un m¿todo para producir rutinariamente la especie radiactiva [11C]CO a partir de [11C]CO2 producido en el ciclotr¿n. Asimismo, se ha dise¿ado e implementado un m¿dulo autom¿tico para la producci¿n de esta especie radiactiva. Fruto del trabajo realizado, ha resultado una publicaci¿n cient¿fica:5- Gona KB, G¿mez-Vallejo V, Llop J; Synthesis of m-carboranyl amides via palladium-catalyzed carbonylation. Tetrahedron Letters, 2013. 54(8): 941-944. A parte del trabajo descrito anteriormente (incluido en la presente tesis doctoral) cabe remarcar que durante la ejecuci¿n de la tesis doctoral he tenido la oportunidad de participar en diferentes proyectos cient¿ficos, que si bien no est¿n reflejados en este manuscrito, han contribuido a obtener una formaci¿n integral y amplia en el ¿rea de la radioqu¿mica y la imagen molecular. Fruto de mi implicaci¿n en estos proyectos, han resultado diferentes publicaciones cient¿ficas en las cuales estoy reflejado como coautor. 6- Soria FN, P¿rez-Samart¿n A, Martin A, Gona KG, Llop J, Szczupak B, Chara JC, Matute C, Domercq M; Extrasynaptic glutamate release through cystine/glutamate antiporter contributes to ischemic damage. The Journal of Clinical Investigation. 2014. 124: 3645-3655. 7- G¿mez-Vallejo V, V¿zquez N, Gona KB, Puigivila M, Gonz¿lez M, San Sebasti¿n E, Martin A, Llop J, Synthesis and in vivo evaluation of 11C-labeled (1,7-dicarba-closo-dodecaboran-1-yl)-N-{[(2S)-1-ethylpirrolidin-2-yl]methyl}amide. Journal of labeled compounds and radiopharmaceuticals. 2014. 57: 209-214. DOI: 10.1002/jlcr.31598- G¿mez-Vallejo V, Gaja V, Gona KB, Llop J; Nitrogen-13: Historical review and future perspectives; Journal of labeled compounds and radiopharmaceuticals. 2014. 57: 244-254.