Desarrollo de nuevas herramientas moleculares de análisis de marcadores microsatélites destinadas a incrementar el poder de discriminación de los perfiles genéticos humanos

Abstract

Hoy en dia el an6lisis marcadores microsat¬lites es la tecnica de referencia empleada para laidentificaci6ng endticah umanaa si como para la determinaci6nd e parentescob iol6glco. En estes¬ntido, los laboratorios disponen de un variado abanico de reacciones comerciales altamentediscriminalivays sensibleqsu ep ermitena bordadr e un modoe ficaze l anelisisd ¬ lasd iferentesmuesfas forenses. A pesar de ello, existen determinados casos donde la eficacia de dichasreacciones rcsulta ain insuficiente, como es el an6lisis de muestms d¬gmdadas y ladeterminaci6n de casos de parcntesco complejos, ya que mediante su utilizaci6n no se loglaalcanzarl a probabilidadd e discriminaci6nn ecesariap arar ealizare l diagn6sticor equerido.El presentetr abajo de tesis doctorale sti dirigido a solventare stasl imitaciones.E n estes entido,se han desanollado y validado dos nuevas herramientas moleculares basadas ¬n el an{lisismedianteP CR multiplex de marcadorcsm icrosatdlitesL. a primem herrarnientah a sido disefradaespecificamentep ara ser utilizada en el analisis de ADN altarnented egradado.A su vez, lasegundah erramientah a sido disefiadap ara aumentare l nimero total de marcadoresa nalizadosincr¬mentandoa si el poder de discriminaci6n total aportadoa la determinaci6nd e casos deparentescoc omplejos.La aplicaci6nd e sendash erramientasp ermite en cadac asoa umentar¬ l poderd e discrimjnaci6nde los perfilesg endticoso btenidosre duciendoIa s limitacionesq ue las reaccionems ultiplexconvencionalesp r¬sentanp ara el anelisisd e muestrasd egadadasy la determinaci6nd e casosde parentesccoo mDleio ESS. Asimismo, el diseño de la combinación basado en la tecnología miniSTRspermite amplificar 14 marcadores STRs más AMELOGENINA con tamaños incluso inferioresa 230 pb.La estrategia de diseño seguida para la combinación I-DNADuo permite analizar unmayor número de marcadores en formato miniSTR y paralelamente posibilita, mediante laduplicación de resultados, detectar y evitar la presencia de pérdidas alélicas producidas tantopor amplificación preferencial como por presencia de mutaciones en las regiones 3¿de uniónde los cebadores.La comparación de la eficacia de la combinación I-DNADuo frente a sistemasmultiplex comerciales para analizar muestras de tejidos embebidos en parafina permitióconfirmar la gran aplicabilidad de esta combinación para el análisis ADN altamentefragmentado, incrementando el poder de discriminación total obtenido así como la fiabilidadde los resultados obtenidos. Asimismo, los buenos resultados obtenidos mediante lautilización de cualquiera de los componentes de I-DNADuo en combinación con los STRmultiplex comerciales Minifiler¿ y NGM¿ revelaron la gran versatilidad de estasherramientas tanto para su uso conjunto como para su combinación con reacciones multiplexpreexistentes.La segunda herramienta molecular diseñada y validada en el presente trabajo de tesisdoctoral es un nuevo sistema multiplex denominado I-DNASE21. Dicho sistema multiplex hasido específicamente diseñado para amplificar en una sola reacción 21 STRs autosómicosmás una región del locus AMELOGENINA. De este modo I-DNASE21 permite laamplificación de todos los marcadores incluidos en las principales bases de datos, entre lasque se incluyen el CODIS, la ISSL, la ESS, la GCL y la ESS-Extended.I-DNASE21 es, hasta la fecha, la única reacción que permite la amplificación de latotalidad de los marcadores incluidos en las principales bases de datos mediante una únicareacción basada en la tecnología ¿5-dye-Chemistry¿. Este hecho sumado a la alta tasa deconcordancia mostrada entre I-DNASE21 y reacciones comerciales preexistentes permite quelos perfiles genéticos obtenidos mediante su aplicación puedan ser contrastados con losalmacenados en cualquiera de las bases de datos de perfiles genéticos, anteriormente citadaslo que posibilita el uso globalizado de los perfiles genéticos obtenidos a partir de estareacción. Del mismo modo, el alto poder de discriminación aportado en una única reacciónsugiere la gran aplicabilidad de I-DNASE21 para la resolución de casos de parentesco en losque la ausencia de uno de los progenitores pueda provocar un aumento en la probabilidad deobtener falsos parentescos producidos por azar.Adicionalmente, I-DNASE21 es una excelente herramienta para analizar un altonúmero de marcadores STRs autosómicos en grandes muestras poblacionales. Este hecho,facilitaría el aumento de la capacidad de los estudios poblacionales para determinar ladistribución de las frecuencias alélicas, detectar presencia de sub-estructuras poblacionales einferir flujos migratorios.