Evaluacion de la calidad embrionaria de ovocitos criopreservados

Resumen

Introducción La criopreservación de ovocitos es una opción de gran utilidad para la preservación de la fertilidad, así como para solucionar diferentes situaciones clínicas observadas en Reproducción Asistida, y para la creación de bancos de ovocitos para donación. La técnica de criopreservación de ovocitos más comúnmente empleada durante casi 25 años de investigaciones ha sido la congelación lenta. Desafortunadamente, la utilización de esta técnica aún no está muy difundida, ya que los resultados obtenidos hasta la fecha han sido claramente insuficientes y de escasísima reproducibilidad. Por este motivo, la congelación lenta ha experimentado diferentes modificaciones, con el fin de mejorar los resultados. Una de ellas ha sido el incremento en la concentración del crioprotector no permeable (sacarosa) y otra la congelación de los ovocitos rodeados de las células del cúmulo o totalmente decumulados. El objetivo principal de esta tesis ha sido evaluar el potencial de desarrollo de ovocitos congelados utilizando 0,2M vs. 0,3M de sacarosa, teniendo en cuenta la presencia o ausencia de las células del cúmulo. Materiales y Métodos Se han utilizado un total de 755 ovocitos humanos en metafase II (Mll), los que fueron subdivididos en grupo control (n=235) y grupo de estudio que reunió a los ovocitos que fuero congelados. En este grupo los ovocitos fueron distribuidos de acuerdo a la concentración de sacarosa y las células del cúmulo así: grupo 0,2M C+ (n=166) y grupo 0,2M C- (n=38) para los ovocitos congelados con 0,2M de sacarosa y en presencia (C+) o ausencia (C-) de las células del cúmulo. Los ovocitos congelados con 0,3M de sacarosa se subdividieron en 0,3M C+ (n=153) y 0,3M C- (n=150) siguiendo el mismo criterio anterior. Los ovocitos se congelaron en un congelador programable Planer Kryo 10 serie III (Sundbury on Times, England), utilizando protocolo lento con PROH 1,5M como crioprotector permeable y sacarosa 0,2M vs. 0,3M. Tres horas tras la evaluación de la supervivencia, se realizó la ICSI (microinyección intracitoplasmática de espermatozoides). A las 16-18 horas se evaluó la fecundación y el desarrollo embrionario en día dos, tres y en estadio de blastocisto. El análisis cromosómico embrionario (DGP) se realizó mediante FISH efectuada tras la biopsia de blastómeras en día tres. La evaluación morfológica se realizó mediante la medición del diámetro de los ovocitos al microscopio óptico (MO) y mediante estudio de ultraestructura mediante microscopía electrónica de transmisión (MET). Para el estudio de marcadores de retículo endoplásmico liso (REL) se utilizó técnica de inmunocitoquímica indirecta de dos capas. Los marcadores estudiados fueron las proteínas chaperonas: protein disulfuro isomerasa (PDI) y calnexina. Resultados La tasa de supervivencia observada fue 66,2%, 68,4%, 62,0% y 84,6% para los grupos 0,2M C+; 0,2M C-; 0,3M C+ y 0.3MC- respectivamente, siendo significativamente superior para este último (p<0,05). No se observaron diferencias significativas en cuanto a la tasa de fecundación (76,7%; 70,0%; 71,4% y 72,3% respectivamente) con respecto al control (78,2%). La tasa de división en día dos observada fue 84,8%; 78,6%; 83,3%; 47,2% para los congelados (0,2M C+; 0,2M C-; 0,3M C+ y 0,3MC- respectivamente) y 96,2% para los controles, siendo ésta última significativamente superior a la observada en los congelados (p<0,05). Por otra parte la tasa de división más baja se observó en el grupo 0,3M C- (47,2%; p<0,05). En ninguno de los casos en los que se congeló en ausencia de las células del cúmulo (0,2M y 0,3M C-) se alcanzó el estadio de blastocisto. Los valores para los grupos 0,2M C+; 0,3M C+ y controles fueron 52,2%; 25%. La tasa de blastocisto fue significativamente superior para el grupo control (60,7%; p<0,05). No se observaron diferencias estadísticamente significativas en el porcentaje de embriones con anomalías cromosómicas entre los grupos 0,2M; 0,3M y control (25%; 40%; y 37,9% respectivamente). Al analizar las anomalías presentes según cromosoma estudiado, el grupo 0,3M presentó una mayor incidencia de anomalías alcanzando valores estadísticamente significativos en el caso de los cromosomas número 13,18 y 22. De la misma manera al analizar las anomalías concernientes a 4 o más copias de cada cromosoma, este mismo grupo presentó una mayor incidencia de dicha anomalía, siendo significativo en el caso del cromosoma 13. El menor diámetro medio de los ovocitos tras la congelación se observó en le grupo 0,3M 111 ±2,1µm (p<0,05). Este valor fue de 123,3±2,1µm para 0,2M y 132,4±4,7µm para el control. El recuento de gránulos corticales por um lineal de oolema fue 0,26 ± 0,02; 0,45 ± 0,01 para los grupos 0,2m y 0,3M; siendo significativamente superior en el caso de los controles (0,80 ± 0,08; p<0,05). No se observaron alteraciones morfológicas en el estudio de ultraestructura de la ZP, oolema, mitocondrias, REL y demás organelas. Los marcadores de REL (PDI y calnexina) presentaron un patrón de distribución irregular en el espacio perivitelino, que no se observó en ningún caso en los controles. No se observaron diferencias significativas en la distribución de los complejos huso meiótico/placa metafásica de morfología normal: 85,5%; 71,4%; 85,7%; 55,6% y 96,2% 0,2M C+; 0,2M C-; 0,3M C+ y 0, 3MC- y control respectivamente). Conclusiones La deshidratación más severa que ocurre con la congelación lenta de ovocitos utilizando 0,3M de sacarosa se ve potenciada por la ausencia de las células del cúmulo, lo que mejora las tasas de supervivencia aunque produce efectos adversos en el potencial de desarrollo de estos ovocitos. Estos efectos se ven mas marcados en los casos en los que los ovocitos se congelaron con 0,3M de sacarosa en ausencia de las células del cúmulo.