Modulation of neuronal plasticity by events produced in adolescencerole of environmental enrichment and cannabis consumption

Resumen

Resumen general en castellano Disertación Según Linda Spear, la adolescencia es un período de transición entre la juventud y la madurez, caracterizado por la toma de riesgos a nivel de conductual, pero también por un aumento de las hormonas sexuales (Spear, 2000). Además, hay una transformación importante en el cerebro adolescente, particularmente en el hipocampo, la amígdala y la corteza prefrontal. En esas zonas, así como en otras, durante este período se produce una remodelado dendrítico, una intensa mielinización y un fortalecimiento de la neurocircuitería. Las monoaminas dopamina, serotonina y melatonina participan en estos procesos y son cruciales en el comportamiento del adolescente (Arain et al., 2013). Además, en este período crítico, la exposición a algunos eventos como el estrés o el abuso de drogas puede tener un impacto negativo de larga duración. Sin embargo, la exposición a situaciones beneficiosas, como el enriquecimiento ambiental, puede propiciar la adaptación del cerebro al medio ambiente (Marco et al., 2011). La exposición crónica al estrés, ya sea durante el período prenatal, la infancia, la adolescencia, la edad adulta o el envejecimiento, tiene un impacto importante en diferentes estructuras cerebrales relacionadas con la cognición y la salud mental (Lupien, 2009). La exposición repetida al estrés también tiene un impacto importante en el aprendizaje y la memoria, y es especialmente significativo durante el período prenatal y peripubertal. Esto implica una remodelación de los circuitos cerebrales, con efectos funcionales sobre las espinas, la arborización dendrítica y las moléculas relacionadas con la plasticidad, que están mediadas en parte por los glucocorticoides (Vyas et al., 2016; McEwen and Morrison, 2013). Se sabe que el estrés, incluyendo la derrota social, es un factor que precipita los trastornos neuropsiquiátricos, como el trastorno depresivo mayor (MDD) y la esquizofrenia (Negrón-Oyarzo et al., 2015). Además, diferentes tipos de estudios utilizando neuroimagen y otros enfoques han mostrado alteraciones estructurales en la corteza prefrontal, la amígdala, el hipocampo y otras regiones del cerebro vulnerables tanto en el estrés como en los trastornos neuropsiquiátricos (Gilabert-Juan et al., 2013; Radley et al. 2008, Pérez-Cruz et al., 2007, Radley et al., 2005, Shenton et al., 2001). Los procesos de plasticidad que incluyen la remodelación sináptica y dendrítica y la incorporación de nuevas neuronas a los circuitos establecidos, que son cruciales en el aprendizaje y la memoria, están subyacentes a estas alteraciones estructurales. En estos procesos plásticos, la forma polisializada de las moléculas de adhesión celular neural (PSA-NCAM), una molécula relacionada con la plasticidad expresada principalmente en interneuronas (Gómez-Climent et al., 2011, Nácher et al, 2002) parece tener un papel clave. Los cambios en PSA-NCAM se han descrito después del estrés por inmovilización (Gilabert-Juan et al., 2011; Cordero et al., 2005) y la interacción PSA-NCAM-dopamina puede ser relevante para la hipótesis dopaminérgica de la esquizofrenia. Por otra parte, PSANCAM puede ser actor clave en las anormalidades en los circuitos inhibitorios observados en este trastorno neuropsiquiátrico, porque NCAM y una de sus polisialiltransferasas son genes candidatos para la esquizofrenia y la expresión de PSA-NCAM se altera en la corteza prefrontal y el hipocampo de los pacientes esquizofrénicos (Nácher et al., 2013). Además de esto, un gran número de estudios han indicado que la exposición al cannabis está asociada con un mayor riesgo de desarrollar esquizofrenia (Di Forti et al, 2007, Smit et al, 2004, Andréasson et al, 1987), observándose una relación dosis-respuesta entre el consumo de cannabis a los 18 años y el diagnóstico de esquizofrenia 15 años después. Debido al hecho de que sólo el 3% de los usuarios de cannabis desarrolló la esquizofrenia, se sugirió que el cannabis podría ejercer su papel causal sólo en individuos ya vulnerables. Teniendo en cuenta todos estos datos, se planificaron dos estudios diferentes en los que se analiza, por un lado, el efecto del enriquecimiento ambiental durante la adolescencia sobre el estrés social y, por otro lado, el efecto del consumo de cannabis durante la adolescencia en un modelo de esquizofrenia de "doble impacto". Estudio 1. Influencia de un entorno enriquecido durante la adolescencia en la respuesta al estrés psicosocial durante la edad adulta. 1.Objetivos Los dos objetivos principales del estudio 1 fueron: i) examinar los efectos del estrés social sobre el comportamiento social, la memoria, los niveles hormonales y la expresión de interneuronas y PSA-NCAM en la amígdala de ratones machos expuestos al paradigma de "estrés por contacto sensorial" y ii) estudiar la influencia de un enriquecimiento ambiental experimentado durante la adolescencia sobre los efectos potenciales previamente mencionados en la edad adulta. Basamos nuestro estudio en la hipótesis de que la exposición repetida a las interacciones sociales producirá un estado diferente en los ratones (animales dominantes vs. subordinados) que mostrarían diferencias cognitivas y fisiológicas mientras que la exposición previa a un entorno enriquecido compensaría los efectos adversos del estrés. A partir de nuestros dos objetivos principales, derivamos los siguientes objetivos específicos: 1. Analizar si el modelo de estrés por contacto sensorial produce un estado claro, asimétrico (dominante vs. subordinado) en ratones machos, caracterizado por el predominio de categorías conductuales de dominancia (amenaza, ataque) y subordinación (evitación-huida y defensa-sumisión), respectivamente. 2. Evaluar si la exposición a estrés social repetido (modelo de "estrés por contacto sensorial") podría alterar de manera diferente la memoria probada con una tarea de evitación pasiva en función del estado. 3. Analizar si el diferente estatus social derivado del modelo de estrés sensorial de contacto modifica los niveles de corticosterona. 4. Analizar si el "estrés por contacto sensorial" puede modular la expresión de PSA-NCAM, una molécula implicada en la plasticidad estructural, en la amígdala. 5. Evaluar si un ambiente enriquecido influye en los efectos del estrés social sobre el estatus social y las categorías de comportamiento, la memoria, los niveles hormonales y la expresión del PSA-NCAM; una molécula implicada en la plasticidad estructural, y las neuronas parvalbúmina; una subpoblación específica de interneuronas, así como sobre las redes perineuronales (PNNs), un importante regulador de la plasticidad del sistema nervioso central, en la amígdala. Para llevar a cabo dichos objetivos se planificó la metodología que queda reflejada en el siguiente apartado. 2.Material y Métodos. 2.1 Animales Se usaron 78 ratones NMRI machos adultos (cuatro meses de edad) de Harlan (Harlan Laboratories, IN). Todos los experimentos y manipulaciones se realizaron durante la fase oscura del ciclo de luz. Todos los ensayos con animales se realizaron con conformidad con la Directiva 2010/63 / UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados con fines científicos. Cuando los animales llegaron al laboratorio (día 21 postnatal (P21) y 12-14 gramos (g), se alojaron en condiciones estándar, a 21 ºC, con comida y agua ad libitum y con un ciclo reverso luz/oscuridad (apagado: 8:00-20:00 hora local). A su llegada, se alojaron en grupos de cuatro en jaulas de plástico estándar (25x25x15 centímetros) de Panlab (Panlab, S.L.U, UK) en las condiciones descritas anteriormente durante una semana (semana de adaptación). Después de la semana de adaptación (A), los animales siguieron las diferentes fases del protocolo experimental resumido en la figura 1. 2.2 Alojamiento en jaulas con ambiente estándar o en ambiente enriquecido durante la adolescencia. De P28 a P120 (figura 1) los animales se mantuvieron en diferentes condiciones de alojamiento para determinar la influencia de un entorno enriquecido en la respuesta al estrés psicosocial durante la edad adulta. Después de la semana de adaptación (A), 38 de los animales se alojaron en cinco grupos de 8 en un entorno enriquecido. En el paradigma del enriquecimiento ambiental (EE) los animales fueron alojados en jaulas de plástico grandes (55.6x33.4x19.5 cm) (Panlab, SLU, UK) con varios tipos de objetos (casas de plástico, túneles de plástico, (Nithianantharajah and Hannan, 2006). Todos los objetos presentes en estas jaulas fueron retirados y reemplazados una vez a la semana, excepto túneles de plástico, ruedas y casas de plástico. Durante esta fase de alojamiento, los animales se mantuvieron a 21ºC, con comida y agua ad libitum y con un ciclo reverso luz/oscuridad (luces apagadas: 8: 00-20: 00 hora local). Los otros 40 animales se alojaron en diez grupos de 4 en ambiente estándar. En el entorno estándar (SE) los animales se alojaron en jaulas de plástico estándar (25x25x15 cm) de Panlab (Panlab, S.L.U, UK) bajo las condiciones de comida, temperatura y luz/oscuridad previamente descritas. 2.3 Fase de aislamiento. Después del alojamiento en EE o SE (P28 a 120, véase la figura 1), el ciclo de luz / oscuridad se cambió (luces apagadas: 4: 30-16: 30 hora local; véase el período A en la figura 1) debido a razones prácticas; se mantuvieron otras condiciones de laboratorio. Una semana después de este cambio en el ciclo, cuando los animales tenían 127 días de edad, todos los ratones (n = 78) fueron alojados individualmente en jaulas plásticas (20x10x13 cm) durante dos semanas antes de cualquier manipulación, para eliminar el efecto de las interacciones previas del grupo y para facilitar la capacidad de todos los machos de mostrar agresión (Kudryavtseva et al, 1991; Parmigiani y Pasquali, 1979). 2.4 Paradigma del estrés social Después del período (P127 a P141, figura 1) de aislamiento social descrito en el párrafo anterior, los animales fueron asignados a diferentes grupos dirigidos a evaluar los efectos del estrés social utilizando un paradigma de estrés por contacto sensorial. Para establecer el estatus social todos los animales fueron asignados a uno de seis grupos: 1) grupo de cohabitación de estrés social con SE (StSE) 2) grupo de cohabitación de estrés social con EE (StEE), 3) cohabitación sin enfrentamiento y con SE (CCSE), 4) cohabitaciónsin enfrentamiento y con EE (CCEE), 5) grupo de aislamiento con SE (ICSE) y 6) grupo de aislamiento con EE (ICEE). Para asignar animales a los cuatro primeros grupos (1-4), los criterios seleccionados fueron un peso similar entre cada miembro de la pareja. Durante la cohabitación, 60 ratones fueron alojados en parejas en jaulas de plástico (20x20x13 cm) (Panlab) separadas por una pared de metacrilato con pequeños agujeros a través de los cuales los animales podían ver, oír y oler entre sí, pero no tocar (Kudryavtseva et al, 1991). Dos días de adaptación a las condiciones de cohabitación fueron necesarios antes del comienzo de los encuentros agonísticos dentro del paradigma del estrés social. Los 18 animales restantes se mantuvieron aislados, como grupo control. Una hora antes del primer día de encuentros agonísticos, se extrajo sangre de la vena de la cola de todos los animales mediante punción con una aguja de 22 G (BD, EE.UU.) para analizar los niveles de corticosterona. El modelo de estrés por contacto sensorial se llevó a cabo durante diez días consecutivos en la misma jaula en la que se alojaron los ratones, retirando el separador de metacrilato durante 10 minutos. La jaula fue transportada desde la sala de alojamiento a una sala de ensayo iluminada por una luz roja (40 w) a 21oC. La adaptación de un minuto, para la activación del animal, fue necesaria antes de quitar el separador (Kudryavtseva et al, 1991). El último día de los encuentros agonísticos se extrajo sangre de la vena de la cola como se ha descrito anteriormente.Este procedimiento se realizó una hora después del último encuentro, con el fin de analizar los niveles de corticosterona. 2.4.1 Generación de animales dominantes y subordinados. Todos los encuentros agonísticos se registraron utilizando una cámara analógica (SONY handycam ccd TRV 27-8mm). Las cintas de vídeo se analizaron utilizando un ordenador personal con un programa personalizado. Este programa fue desarrollado para evaluar la duración, la frecuencia y la latencia de once categorías de comportamiento presentadas por los roedores durante los encuentros agonísticos (Martínez et al., 1991). Estas categorías comportamentales fueron la preparación, el aseo, la exploración no social, la exploración a distancia, la investigación social, la amenaza, el ataque, evitación-huida, la defensa-sumisión, el comportamiento sexual y la inmovilidad. Cada uno de estos comportamientos está definido por una serie de elementos conductuales (Martínez et al., 1991). Un ratón se definió como dominante si durante los encuentros agonísticos mostraba elementos de ataque y amenaza, pero no elementos característicos del estatus subordinado como evitación-huida o defensa-sumisión. Por el contrario, se definió a un ratón como subordinado si durante los encuentros agonísticos mostraba elementos de evitación-huida y defensa-sumisión, pero no elementos característicos del estado dominante (Rodriguez-Alarcón et al, 2007). Los grupos generados después de los encuentros agonísticos se definieron como sigue: 1) grupo dominante con SE (DSE), 2) grupo dominante con EE (DEE), 3) grupo subordinado con SE (SSE), 4) grupo subordinado con EE (SEE) 5) cohabitación sin enfrentamiento y con SE (CCSE), 6) cohabitación- sin enfrentamiento y con EE (CCEE), 7) grupo de aislamiento con SE (ICSE) y 8) grupo de aislamiento con EE (ICEE). En el presente estudio, hemos analizado sólo los videos del día cinco, siete y diez. 2.5 Test comportamental: evitación pasiva o inhibitoria. Todos los grupos experimentales fueron sometidos a la fase de entrenamiento de evitación pasiva o inhibitoria. En esta fase, cada ratón se introdujo en el compartimento blanco, donde hubo un período de adaptación durante 90 segundos (s). Después de este período, la puerta entre compartimentos se abrió con un máximo de 300 s, sii el animal entra en el compartimiento oscuro, la puerta se cierra y el animal recibe un choque eléctrico de 0.3 miliamperios (mA) con una duración de 5 s. En este paradigma se midió el tiempo empleado para entrar en el compartimiento oscuro, definido como latencia de cruce (medido en décimas de segundo y grabado manualmente). La segunda fase de este procedimiento tuvo lugar una semana después; En esta fase de prueba sólo había una diferencia con respecto a la anterior: el choque eléctrico fue de 0,1 mA y de 1 s de duración. 2.6 Análisis hormonal Como se ha descrito anteriormente, se obtuvieron muestras de sangre para el análisis de corticosterona por punción de la cola una hora antes del primer encuentro agonístico y una hora después del último encuentro agonístico. Una vez establecido el estatus social, y después de la prueba de memoria, la sangre para la testosterona y los análisis de corticosterona se obtuvo por punción cardíaca y los después los ratones fueron sacrificados. Las muestras de sangre se centrifugaron para separar el suero, y después el suero se congeló inmediatamente (-80 ° C). El análisis de corticosterona y testosterona se realizó mediante ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) con kits comerciales. La determinación de la corticosterona sérica, en nanogramos/mililitros (ng/ml), se realizó mediante el ensayo de ELISA utilizando el kit de sistemas de Inmunodiagnostics (IDS Ltd.) (RU). La sensibilidad, definida como la concentración correspondiente a la media menos 2 desviaciones estándar de 20 repeticiones del calibrador cero, fue de 0,55 ng / ml. Los coeficientes de variación inter e intra-ensayo fueron todos inferiores al 10%. La testosterona en suero (ng / ml) se determinó por ELISA usando el kit de sistemas de diagnóstico Demeditec (Alemania). La sensibilidad fue de 0,066 ng/ml. Los coeficientes de variación inter e intra-ensayo fueron todos inferiores al 12%. 2.7 Procedimientos histológicos. 2.7.1 Técnicas de perfusión y microtomía. Después de la última sesión de pruebas de comportamiento, los ratones fueron perfundidos bajo anestesia pentobarbital profunda (1 ml/kg), primero durante 1 minuto con NaCl (0,9%) y luego con paraformaldehído al 4%. La solución de paraformaldehído se suministró durante 25 minutos con un flujo de 4 ml/min. Treinta minutos después de la perfusión, los cerebros se extrajeron del cráneo y sus hemisferios se separaron. Los hemisferios cerebrales fueron crioprotegidos con sacarosa al 30% en PB 0,1 M fría (4ºC) durante 48 horas y luego cortados en secciones coronales de 50 μm usando un microtomo de congelación deslizante (Leica SM2010 R, Leica, Alemania). Los cortes se recogieron en 6 subseries y se almacenaron a 4ºC en PB 0,1 M con azida sódica o se almacenaron a -20ºC en una solución crioprotectora (glicerol al 30%, etilenglicol al 30% en PB 0,1 M) hasta su utilización. 2.7.2 Inmunohistoquímica. Todos los anticuerpos utilizados en esta tesis pueden encontrarse en la tabla 1. Para cada experimento, todas las secciones estudiadas pasaron a través de todos los procedimientos simultáneamente para minimizar cualquier diferencia de la tinción inmunohistoquímica misma. Para evitar cualquier sesgo, todas las preparaciones se codificaron antes del análisis y los códigos no se rompieron hasta que el experimento terminó. 2.7.3 Inmunohistoquímica para microscopía óptica. El tejido fue procesado usando el método de avidina-biotina-peroxidasa (ABC) (Hsu et al, 1981) como sigue: todas las secciones se incubaron durante un minuto con una solución de desenmascaramiento de antígeno (tampón de citrato 0,01 M, pH 6) A 100 ºC. Después de enfriar las secciones a temperatura ambiente, se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3% (H2O2) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 10 minutos para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena. Después de esto, las secciones se incubaron durante una hora con suero normal de burro al 10% (NDS, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA) en PBS con 0,2% de triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Las secciones de tejido se incubaron después durante 48 horas a 4ºC en ratón IgM anti-PSA-NCAM (1: 700, Abcys) en PBS con triton X-100 al 0,2% y NDS al 5%. Después del lavado, las secciones se incubaron durante una hora a 25ºC con anti-ratón biotina SP (1: 400, Jackson Inmunoresearch), en PBS con 0,2% de tritón y 5% de NDS. A continuación, las secciones se incubaron con un complejo de avidina-biotina-peroxidasa (ABC, Vector Laboratories, Peterborough, RU) en PBS durante 30 minutos. La marca se consiguió incubando con tetrahidrocloruro de diaminobencidina 3,3 ', DAB (Sigma Aldrich) durante 4 minutos. Después de esto, se montaron secciones sobre portaobjetos, se secaron durante un día a temperatura ambiente, se deshidrataron con alcoholes (PANREAC, España) y se aclararon en xileno (Sigma-Aldrich). Finalmente, las secciones se cubrieron utilizando medio de montaje Eukitt. 2.7.4 Inmunohistoquímica para la microscopía confocal Los cortes coronales de 50 μm se incubaron durante 1 hora con suero normal de burro al 10% (Biowest LLC, Kansas City, EE.UU.) en PBS con Triton-X100 al 0,2% (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO). Después de esto, las secciones se incubaron durante 24 horas a 25ºC con anti-parvalbúmina policlonal de conejillo de indias (1: 2000, synaptic systems) y con lectina de Wisteria Floribunda conjugada con biotina (WFA) (1: 200, Sigma). Después de ser lavadas, las secciones se protegieron a la luz y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente en anticuerpo anti conejo conjugado con Cy3 y generado en asno y Streptavidin Alexa Fluor 647. Todas las secciones se montaron en portaobjetos y se cubrieron con un medio de montaje para fluorescencia DakoCytomation (Dako North America Inc., Carpinteria, CA). La histoquímica WFA es una histoquímica especial diseñada para detectar PNNs, que son estructuras que contienen glicocoproteinas. Este tipo de estructura puede ser reconocido porque la lectina de la planta Wisteria Floribunda se une a N-acetilgalactosamina (GalNac-) (Härtig et al., 1992). 2.8 Análisis de los niveles de expresión de PSA-NCAM. Para analizar la expresión de PSA-NCAM en las secciones procesadas, se tomaron fotografías de diferentes núcleos de la amígdala de animales con diferentes condiciones experimentales. En el estudio 1 estudiamos los siguientes núcleos: Núcleo amígdaloide lateral (La), núcleo amígdaloide basolateral (BL), núcleo amígdaloide central (Ce), núcleo amígdaloide mediano (Me) y núcleo amígdaloide basomedial, parte anterior (BMA) en Bregma: -1,58 mm, interaurales: 2,22 mm de acuerdo con el Atlas del cerebro de ratón (Paxinos y Franklin, 2001). En resumen, a partir de cada sección de examinada por animal con el microscopio Olympus CX41 bajo iluminación de campo claro, homogéneamente iluminada y digitalizada utilizando una cámara CCD (C-5060 zoom ancho, OLYMPUS, España), se tomaron fotografías de los diferentes núcleos de amígdala Se midieron los promedios, se promedió el fondo y se convirtieron los valores en densidades ópticas (OD) utilizando el software FIJI (NIH) (Schindelin et al , 2012). Los niveles de gris se calcularon a partir de una escala relativa de intensidad que variaba de 0 a 255; 0 correspondientes a niveles de unión no específicos y 255 correspondientes a la mayor intensidad de etiquetado. Se midieron los niveles de gris no específicos en las secciones teñidas del corpus callosum (Bregma: -1,58 mm, interaurial: 2,22 mm (Paxinos y Franklin, 2001) 2.9 Densidad de células de parvalbúmina y redes perineuronales. Las secciones se procesaron para la inmunohistoquímica de parvalbúmina (PV) y la detección histoquímica de PNNs y se observaron con un microscopio confocal (Olympus Fluoview FV 10i, Olympus, Japón) usando un objetivo 10x. Estimamos la densidad de células que expresan PV o rodeadas de redes perineuronales (PNN) en el el núcleo central de la amygdala (Ce) Bregma: -1,58 mm, interaural: 2,22 mm de acuerdo con el Mouse Brain Atlas (Paxinos y Franklin, 2001). El área del Ce se determinó para cada animal. El resultado se expresa como el número de células positivas inmunorreactivas por mm2. Estudio 2. Impacto de la administración de delta-9-tetrahidrocannabinol durante la adolescencia. 1.Objetivos 1. Evaluar el impacto del delta-9-tetrahidrocannabinol (THC) administrado durante la adolescencia en ratones criados en grupo. 1.1 Estudiar los efectos del THC en una prueba de comportamiento en la que interviene la corteza prefrontal (PFC): la inhibición por prepulso del reflejo de sobresalto (PPI). 1.2 Estudiar los efectos del THC sobre el volumen de la corteza prefrontal medial (mPFC), la estructura de interneuronas y la expresión de moléculas relacionadas con la neurotransmisión inhibidora en esta región neocortical. 2. Evaluar si el tratamiento con el antagonista del receptor de canabinoides tipo 1 (CB1r) AM251 durante la edad adulta puede paliar o revertir los efectos de la administración de THC en ratones criados en grupo. 3. Evaluar el impacto del THC administrado durante la adolescencia en un modelo de esquizofrenia de "doble impacto". 3.1 Estudiar los efectos del THC en una prueba de comportamiento en la que el PFC está involucrado: el PPI. 3.2 Estudiar los efectos del THC sobre el volumen de la mPFC, la estructura de las interneuronas y la expresión de moléculas relacionadas con la neurotransmisión inhibidora, en esta región neocortical. 4. Investigar si el tratamiento con el antagonista CB1r, AM251 durante la edad adulta puede paliar o revertir los efectos de la administración de THC en un modelo de esquizofrenia de "doble impacto". Con el fin de lograr estos objetivos, planifiqué dos experimentos en el estudio 2. En el primer experimento, me propuse estudiar los efectos de la administración de THC durante la adolescencia en ratones criados en grupo, analizar el impacto en la corteza prefrontal y explorar una posible reversión de los efectos por el tratamiento AM251 durante la edad adulta. En el segundo experimento, quería estudiar los efectos de la administración de THC durante la adolescencia en un modelo de esquizofrenia de "doble impacto" y analizar su impacto en la corteza prefrontal y una posible reversión por el tratamiento con AM251 durante la vida adulta. 2. Material y Métodos. 2.1 Animales. Ciento veintiocho ratones machos cuyas neuronas inhibidoras expresan GFP (GINs, Tg (GadGFP) 45704Swn) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, EE.UU.) (Oliva et al, 2000) de diferentes camadas criadas en nuestras instalaciones fueron Utilizado en este experimento. Se mantuvieron bajo condiciones estándar de luz (ciclo de luz-oscuridad de 12 horas) y temperatura con alimento y agua disponibles ad libitum. Toda la experimentación con animales se realizó de conformidad con la Directiva 2010/63/ UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010, relativa a la protección de los animales utilizados con fines científicos y fue aprobada por el Comité de Bioética de la Universitat de València. En el experimento 1 y en el experimento 2 los animales empleados fueron de la misma cepa. Detallamos a continuación el alojamiento y tratamientos específicos para cada experimento. Experimento 1. Efectos del delta-9-tetrahidrocannabinol durante la adolescencia en ratones socialmente criados. Impacto en la corteza prefrontal y la reversión putativa por AM251 tratamiento durante la edad adulta. 2.2 Alojamiento y tratamientos farmacológicos En el día 7 posnatal (P7), los animales (n = 64) recibieron una inyección intraperitoneal de solución salina (0,9%). En P21, después del destete, los animales se mantuvieron en grupos de 3-4 animales, formando así ratones alojados en grupo y con solución salina (NaCl / soc, n = 64). Durante la adolescencia, de P28 a P48 (Spear, 2000), los animales recibieron una inyección intraperitoneal diaria de delta-9-tetrahidrocannabinol (THC, 10mg / kg) (THC Pharm GmbH, Alemania), el compuesto psicoactivo de cannabis o vehículo 1 (mezcla 1: 1: 18 de etanol: Tween 80®: solución salina) (Long et al, 2012), formando así dos grupos: alojados en grupo, inyectados con solución salina e inyectados con vehículo 1 (NaCl / Soc-VEH1, n = 32) , Alojados en grupo, inyectados con solución salina e inyectados con THC (NaCl/Soc-THC, n = 32). Durante la edad adulta, de P110 a P130, los dos grupos previamente descritos recibieron una inyección intraperitoneal diaria del agonista / antagonista inverso del receptor CB1, AM251 (1 mg / kg, Tocris Bioscience, Bristol, UK) 2 (mezcla 1: 1: 18 de DMSO: Tween 80®: solución salina), produciendo finalmente cuatro grupos experimentales: alojados en grupo, inyectados con solución salina, inyectados con vehículo 1 e inyectados con vehículo 2 (NaCl / Soc-VEH1-VEH2, n = 16) , Alojados en grupo, inyectados con solución salina, inyectados con vehículo 1 e inyectado con AM251 (NaCl / Soc-VEH1-AM251, n = 16), alojados en grupo, inyectados con solución salina, inyectados con THC e inyectados con vehículo 2 (NaCl / Soc-THC-VEH2, n=16), alojados en grupo, inyectados con solución salina, inyectados con THC e inyecctados con AM251 (NaCl / Soc-THC-AM251, n = 16. Experimento 2. Efectos del delta-9-tetrahidrocannabinol durante la adolescencia en un modelo de "doble golpe" de la esquizofrenia. Impacto en la corteza prefrontal y la reversión putativa por AM251 tratamiento durante la edad adulta. 2.3 Alojamiento y tratamientos farmacológicos En el día 7 posnatal (P7), los animales (n = 64) recibieron una inyección intraperitoneal del antagonista no competitivo del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA), dizocilpina (MK801, 1 mg / kg) (Abcam Biochemicals , Cambridge, UK) disuelto en solución salina (0,9%). A P21, después del destete, los animales se alojaron bajo aislamiento, formando así ratones aislados y MK-801 inyectados (MK801 / Iso, n = 64). Durante la adolescencia, de P28 a P48 (Spear, 2000), los animales recibieron una inyección intraperitoneal diaria de delta-9-tetrahidrocannabinol (THC, 10mg/kg) (THC Pharm GmbH, Alemania), el compuesto psicoactivo de cannabis o vehículo 1 (mezcla 1: 1: 18 de etanol: Tween 80®: solución salina) (Long et al, 2012), formando así dos grupos: aislados, MK801 e inyectados con vehículo 1 (MK801 / Iso-VEH1, n = 32) , aislado, MK801 e inyectados con THC (MK801 / Iso-THC, n = 32) Durante la edad adulta, de P110 a P130, los dos grupos previamente descritos recibieron una inyección intraperitoneal diaria del agonista / antagonista inverso del receptor CB1, AM251 (1 mg / kg, Tocris Bioscience, Bristol, UK) 2 (mezcla 1: 1: 18 de DMSO: Tween 80®: solución salina), produciendo finalmente cuatro grupos experimentales: aislados, inyectados con MK801, inyectados con vehículo 1 e inyectados con vehículo 2 (MK801 / Iso-VEH1-VEH2, n = 16), aislados, inyectados con MK801, inyectados con vehículo 1 e inyectados con AM251 (MK801 / Iso-VEH1-AM251, n = 16), aislados, inyectados con MK801, inyectados con THC e inyectados con vehículo 2 (MK801 / Iso-THC-VEH2, n = 16), aislados, inyectados con MK801, inyectados con THC e inyectados con AM251 (MK801 / Iso-THC-AM251, n = 16). Después del segundo tratamiento, administrado durante la edad adulta, (AM251 o VEH2), evaluamos los posibles déficits de atención y la función de la corteza prefrontal utilizando la prueba de inhibición por prepulso de la respuesta de sobresalto (PPI). A continuación se detalla toda la metodología usada tanto en el experimento 1 como en el experimento 2. 2.4 Inhibición por prepulso de la respuesta de sobresalto Inhibición por prepulso de la respuesta de sobresalto se utiliza comúnmente como un modelo para estudiar la integridad de los mecanismos automáticos inhibitorios centrales de la atención en roedores. PPI es la reducción de la respuesta de sobresalto vista después de un estímulo débil, o prepulso, presentado antes del inicio del estímulo o pulso intenso. Las respuestas de sobresalto se midieron usando el sistema combinado Startle y Fear de Panlab (Barcelona, ​​España). La cámara experimental tenía paredes negras y una puerta frontal transparente montada sobre una plataforma. El movimiento del animal en el cilindro fue detectado por cuatro células de carga situadas en la plataforma. El altavoz, situado en la parte superior de la cámara proporcionó ruido de fondo blanco, pre-pulsos y pulsos. La cámara experimental se colocó en una jaula de aislamiento acústico ventilado. La presentación de los estímulos fue controlada por el software STARTLE y la respuesta de sobresalto se transmitió a los módulos experimentales específicos del software a través de la unidad de células de carga para fines de grabación y para el análisis posterior. Las sesiones de prueba fueron precedidas por una fase de habituación consistente en tres sesiones en las que los ratones se colocaron en el aparato durante cinco minutos sin ruido de fondo. Las sesiones de prueba consistieron en no ensayos de estímulo, ensayos de pulso, ensayos de pre-pulso y ensayos de pulso de pre-pulso. Cada prueba de no estímulo consistió sólo en un ruido de fondo, los ensayos de pulso consistieron en un pulso de 40 ms de 120 decibeles (dB), el ensayo previo al impulso consistió en un ensayo de pulso de 20 ms 73, 76 ó 82 dB y consistió en Un 20 ms 73, 76 u 82 dB seguido 100 ms después por un pulso de 40 ms de 120 dB. Las sesiones de prueba comenzaron con un período de aclimatación de 5 minutos utilizando un ruido de fondo de 70 dB. Las sesiones de prueba consistieron en diez ensayos basales de pulso y diez presentaciones de cuatro ensayos diferentes previamente descritos. Los ensayos se presentaron en orden pseudoaleatorio con un intervalo intertrial (ITI) de 22 segundos y un intervalo interstimulus de 100 ms. El porcentaje de inhibición por prepulso de la respuesta de sobresalto se calculó usando la siguiente fórmula: 100 - {[(respuesta de sobresalto para prepulso + pulso) / (respuesta de sobresalto para pulso solo)] x100}. 2.5 Técnicas de perfusión y microtomía. Un día después de la prueba PPI, todos los ratones utilizados para técnicas histológicas fueron perfundidos bajo anestesia pentobarbital profunda (1 ml/kg), primero durante 1 minuto con NaCl (0,9%) y luego con paraformaldehído al 4%. La solución de paraformaldehído se suministró durante 25 minutos con un flujo de 4 ml / min. Treinta minutos después de la perfusión, los cerebros se extrajeron del cráneo y sus hemisferios se separaron. Los hemisferios cerebrales destinados a estudiar la arborización dendrítica y la densidad de espinas se almacenaron en tampón de fosfato (PB) 0,1 M (4ºC) con azida sódica 0,05% hasta cortar con un vibratoma (Leica VT 1000E, Leica, Alemania) en cortes coronales de 100 μm de espesor. Los otros hemisferios cerebrales fueron crioprotegidos con 30% de sacarosa en frío PB 0,1 M (4ºC) durante 48 horas y después cortaron en secciones coronales de 50 μm utilizando un microtomo de congelación deslizante (Leica SM2010 R, Leica, Alemania). Los cortes se recogieron en 6 subseries y se almacenaron a 4ºC en PB 0,1 M con azida sódica o se almacenaron a -20ºC en una solución crioprotectora (glicerol al 30%, etilenglicol al 30% en PB 0,1 M) hasta su utilización. 2.6 Extracción y disección de tejidos frescos de la corteza prefrontal medial (CPFm) Los ratones utilizados para el análisis de la expresión génica se sacrificaron con una inyección de una dosis letal de pentobarbital sódico (10 ml/kg). Los cerebros se retiraron inmediatamente del cráneo y se colocaron en placas de Petri llenas de tampón de fosfato estéril frío (PB). El cerebro se separó en los dos hemisferios y cada hemisferio se almacenó en tubos de microcentrífuga separados. Los hemisferios se congelaron en nitrógeno líquido y se mantuvieron a -80 ºC hasta su utilización. Después de descongelar los hemisferios, se eliminó la pia bajo un microscopio estéreo (SZX7, Olympus) y se hicieron cortes coronales para retirar porciones de los polos rostral y caudal. El CPFm de los hemisferios izquierdo y derecho se diseccionó con un microescalpelo en condiciones estériles y luego se almacenaron en tubos de microcentrífuga separados. El procedimiento completo se realizó con temperatura fría y bajo condiciones libres de ARNasa para prevenir la degradación del ARN. 2.7 Inmunohistoquímica. En la Tabla 1 se puede encontrar información detallada sobre todos los anticuerpos utilizados en esta tesis. Para cada experimento, todas las secciones estudiadas pasaron por todos los procedimientos simultáneamente para minimizar cualquier diferencia con la tinción inmunohistoquímica misma. Para evitar cualquier sesgo, todas las preparaciones se codificaron antes del análisis y los códigos no se rompieron hasta que el experimento se terminó. 2.7.1 Inmunohistoquímica para microscopía confocal Se utilizaron cortes coronales de 100 micras de grosor para la inmunohistoquímica de GFP. Se utilizaron secciones coronales de 50 μm para las otras inmunohistoquímicas. En general, las secciones se trataron durante 1 hora con suero normal de burro al 10% (Biowest LLC, Kansas City, EE.UU.) en PBS con Triton-X100 al 0,2% (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO). Después de esto, las secciones se incubaron con cócteles diferentes de dos, tres o cuatro anticuerpos primarios (tabla 1). Después de ser lavadas, las secciones se protegieron a la luz y se incubaron una hora a temperatura ambiente con los anticuerpos secundarios apropiados (tabla 1). Todas las secciones se montaron en portaobjetos y se cubrieron con un medio de montaje fluorescente DakoCytomation (Dako North America Inc., Carpinteria, CA). Cuando era necesario utilizar dos anticuerpos primarios generados en la misma especie para la misma inmunohistoquímica, se usaron anticuerpos secundarios específicos de subclase. Histoquímica para la detección de redes perineuronales (PNN) utilizando Wisteria Floribunda (WFA). Se emplearon cortes coronales de 50 μm. En general, las secciones se trataron durante 1 hora con suero normal de burro al 10% (Biowest LLC, Kansas City, EE.UU.) en PBS con Triton-X100 al 0,2% (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO). Después de esto, las secciones se incubaron con lectina de Wisteria Floribunda biotinilada (1: 200, Sigma) (tabla 1) durante 24 horas a 25 ºC. Después de haber sido enjuagadas, las secciones se protegieron a la luz y se incubaron una hora a temperatura ambiente con estreptavidina Alexa Fluor 647 (1:400, Invitrogen) durante 1 hora a 25ºC. Todas las secciones se montaron en portaobjetos y se cubrieron con un medio de montaje para fluorescencia, DakoCytomation (Dako North America Inc., Carpinteria, CA). 2.8 Análisis volumétrico. Se midieron los volúmenes de las diferentes regiones de CPFm (corteza infralímbica, IL, corteza prelímbica, PrL, corteza cingulada, área 1 (Cg1) y corteza cingulada, área 2 (Cg2) en secciones teñidas para PV y PNN, usando el complemento Volumest en la ImageJ Software (NIH, USA), que utiliza el principio de Cavalieri (Gundersen y Jensen, 1987) . En primer lugar, las imágenes de todas los cortes se adquirieron con un microscopio confocal (Olympus FV-10, Olympus, Japón). Después de eso, las medidas de las áreas se estimaron en imágenes que contenían: corteza prelímbica en Bregma de 3,08 mm a 1,70 mm; Corteza infralímbica en Bregma 1,94 mm a 1,42 mm; Cingulado 1 corteza en Bregma 2,34 mm a - 0,22 mm; Corteza cingulada 2 en Bregma 1,42 mm a - 0,22 m. 2.9 Análisis de arborización dendrítica en interneuronas GFP +. La arborización dendrítica se estudió en Cg1 y Cg2 utilizando microscopía confocal (Leica TCS SPE, Leica, Alemania). Secciones ópticas (separadas 0,2 μm) que cubren el árbol dendrítico de las interneuronas fueron seleccionadas (6 neuronas por ratón). Para poder ser analizadas, las neuronas que expresan GFP tenían que cumplir las siguientes características: (1) la célula no debe mostrar ninguna dendrita truncada, (2) el árbol dendrítico de la célula debe mostrar al menos un proceso con una longitud mayor de 120 m y (3) el soma debe estar situado al menos a 30 μm de profundidad desde la superficie del tejido. Las imágenes obtenidas se procesaron utilizando el software FIJI (NIH, USA) (Schindelin et al, 2012) para realizar reconstrucciones en 3D, en las que se analizó la distancia exacta de los puntos ramificados y terminales de las dendritas de una interneurona dada. El grado de arborización dendrítica se analizó mediante un procedimiento para derivar el perfil de Sholl. El análisis de Sholl consiste en la medida del número de intersecciones de las dendritas con esferas de radio creciente centradas en el soma (Sholl, 1953) 2.10 Análisis de la densidad de espinas dendríticas. En este experimento se estudió también la densidad de espinas dendríticas en los ccorteza cingulada Cg1 y Cg2, utilizando microscopía confocal (Leica TCS SPE, Leica, Alemania). Las dendritas individuales se seleccionaron de las neuronas que expresan GFP en la capa III del Cg1 y Cg2 (seis neuronas por animal). Se obtuvieron pilas de imágenes confocales con un objetivo de inmersión de aceite 63x / 1,40 y un zoom digital adicional de 3,5. Las espinas se contaron en tres fragmentos dendríticos (50 μm cada uno) expandiéndose 150 μm desde el soma. Las imágenes obtenidas se procesaron con el software FIJI (NIH), utilizando el complemento Stitching para reconstruir una imagen 3D de dendritas apicales. La herramienta multipunto se utilizó para contar las espinas. 2.11 Balance de excitación-inhibición. Se estudió la densidad de puncta que expresa el transportador vesicular de glutamato 1 (VGLUT1) y el transportador vesicular de GABA (VGAT) en planos confocales seleccionados de diferentes regiones de la CPFm (IL, PrL, Cg1 y Cg2): IL y PrL correspondientes al nivel de Bregma de 1,78 mm Cg1 y Cg2 correspondientes a un nivel de Bregma de 1,10 mm. Los planos z del confocal que cubrían toda la profundidad de las secciones se tomaron con un pasada de 1 μm y sólo se seleccionaron subconjuntos de planos confocales con el nivel óptimo de penetración para cada anticuerpo. En estos planos, se seleccionaron pequeñas regiones del neuropilo (500 μm2) para el análisis, con el fin de evitar vasos sanguíneos y células somáticas. Las imágenes se procesaron usando el software FIJI (NIH, USA) de la siguiente manera: el fondo se restaba con un valor de balanceo de 50, se convirtió a imágenes de 8 bits de profundidad y se binarizó usando un valor de umbral determinado. Este valor dependía del marcador analizado y se mantuvo para todas las imágenes del mismo marcador analizado. A continuación, las imágenes se procesaron con un filtro de desenfoque gaussiano para reducir el ruido. Finalmente, se contó el número de puntos resultantes por región. Los resultados se expresaron para VGLUT1 y VGAT como el número de puncta/m2 y para el balance E/I como el número de puncta VGLUT1/número de puncta VGAT. 2.12 Análisis de la densidad de puncta perisomático en neuronas piramidales. Las secciones procesadas para la inmunohistoquímica CaMKII-α, CB1r, SYN y GFP se observaron bajo un microscopio confocal (Olympus FV 10i, Olympus, Japón) usando un objetivo de aceite 60x. Los puncta perisomáticos en las neuronas piramidales se analizaron en la capa III de dos regiones de la CPFm: IL y PrL. Los análisis se realizaron en secciones correspondientes a Bregma 3.08mm / Interaural 6.88mm y Bregma -0.22mm / Interaural 3.58mm, según el atlas de Paxinos y Franklin (Paxinos y Franklin, 2001) planos en z que cubren toda la profundidad de Las secciones se tomaron con un tamaño de pasada de 1 μm y sólo se seleccionaron subconjuntos de planos confocales con el nivel óptimo de penetración para cada anticuerpo. Las imágenes fueron procesadas utilizando el software FIJI (NIH) de la siguiente manera: las imágenes fueron procesadas con un filtro de desenfoque para reducir el ruido y separar puncta estrechamente conectados. Se extrajo el perfil de soma de las neuronas piramidales y se analizaron puntos situados dentro de un área de 0,5 μm distal del borde de este perfil. Un puncta se definió como una área no menor de 0,15 y no mayor de 2,5 μm2 (Di Cristo et al, 2007). A continuación, se restaba el fondo con un valor de rodadura de 50, se convirtió a imágenes de 8 bits de profundidad y se binarizó usando un valor de umbral determinado. Este valor dependía del marcador y del área analizada y se mantuvo igual para todas las imágenes con el mismo marcador y área. Se analizaron quince neuronas por animal y región. Finalmente, se obtuvieron valores de densidad puncta para CaMKII-α, CB1r, SYN y GFP de cada neurona y se expresaron como número de puncta por micrómetro de perímetro de soma. 2.13 Densidad de células que expresan la parvalbúmina y redes perineuronales. Como en estudio 1. 2.14 Cuantificación de la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa. El ARNm total de CPFm se extrajo utilizando RNeasy Mini Kit de QIAgen (QIAgen, Alemania) mediante un procedimiento de homogenización/lisis de una etapa. El Reactivo de Lisis QIAzol homogeneizó el tejido. Después se utilizó la homogeneización mecánica con TissueLyser LT (QIAgen, Alemania). A continuación, se añadió cloroformo a la muestra y la mezcla se centrifugó. Este paso separa la muestra en tres fases: una fase acuosa (superior) incolora, una interfase blanca y una fase orgánica (inferior) roja. La fase acuosa superior se colocó en un tubo separado y el ARN se recuperó de él mediante precipitación con etanol. Finalmente, el ARN se aisló por varios pasos a través de las columnas de sílice-membranas RNeasy spin. El RNA total purificado se eluyó en agua libre de ARNasa y se midió la concentración y pureza de ARN en un espectrofotómetro a 260 nm y 260/280 nm, respectivamente (Eppendorf BioPhotometer plus; Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania). El RNA se almacenó a -80ºC hasta el siguiente paso. Las reacciones de transcripción inversa (RT) se realizaron usando SuperscriptTM II Reverse Trancriptase (InvitrogenTM, Thermo Fischer Scientific, EE.UU.) de la siguiente manera: 1 μl de Oligo (dT) 12-18 (500 μg / ml), 1 μl de ARN total Ng / μl), se añadieron 1 μl de mezcla de dNTP (10 mM) y 10 μl de agua destilada estéril a un tubo de microcentrífuga libre de nucleasa y todo el contenido se calentó hasta 65 ° C durante 5 min y se enfrió rápidamente sobre hielo. El ADNc de la primera cadena se sintetizó a continuación incubando el ARN hibridado a 42 ° C durante 50 minutos con dGTP, dTTP, dCTP, dATP (1 mM cada uno), 1 μl de inhibidor de RNAse Protector (40 U / μl), 2 μl 1, 4-ditio-DL-treita (DTT, 0,1 M) 1 \ mu l de expandir la transcriptasa inversa (50 U / \ mu l) en 20 \ mu l de tampón de primera cadena. Las reacciones de cDNA se diluyeron entonces cinco veces en agua libre de nucleasa. Para los análisis cuantitativos de retrotranscripción-reacción en cadena de polimerasa (qRT-PCR), cada muestra se realizó en duplicados. QPCR se llevó a cabo con el Detector de Secuencia ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) utilizando mezcla maestra EVA Green PCR (Applied Biosystems), cebadores específicos para todos los genes (Tabla 3) a una concentración de 240 nm, y 4 μl de cDNA (50 ng) De cada muestra. Se usó el gen de la proteína de unión a la caja de TATA (TBP) como un gen de referencia. Después de una desnaturalización a 95ºC durante 10 min, las reacciones se sometieron a ciclos 40 veces con una desnaturalización a 95ºC durante 15 s, y una etapa de hibridación a 60ºC durante 1 min. Después de eso, se realizó una curva de fusión para evaluar la especificidad de los cebadores. Los primers fueron diseñados por Primer Blast software libre. Todos los cebadores de oligonucleótidos de ADN se sintetizaron por encargo por Metabion international AG (Martinsried, Alemania). La cuantificación relativa se realizó utilizando el método de umbral comparativo (CT) según el método de 2-DDCt (Pfaffl y Pfaffl, 2001), donde, DDCT = (CT, gen diana, gen de referencia) exp. Grupo - (CT, gen diana - CT, gen de referencia) grupo de control. Los cambios en la expresión génica se informaron como cambios de pliegues en relación con los controles. CONCLUSIONES. Conclusiones derivadas del estudio 1. 1. El modelo de "estrés por contacto sensorial" produce una asimetría clara (dominante vs. subordinado) en ratones machos NMRI, caracterizado por el predominio de categorías conductuales de dominancia (amenaza, ataque) y subordinación (evitación-huida y defensa-sumisión) respectivamente. 2. La exposición a estrés social repetido (modelo de estrés por contacto sensorial) no afecta a la memoria probada con una tarea de evitación pasiva en función del estatus 3. El estatus social derivado del modelo de estrés sensorial de contacto modificó los niveles de corticosterona en ratones dominantes y subordinados. 4. La expresión de PSA-NCAM en la amígdala no se ve afectada por el estrés por contacto sensorial aplicado en la edad adulta. 5. El entorno enriquecido no influye en los efectos del estrés social sobre el estatus social y las categorías comportamentales. 6. El entorno enriquecido no influye en los efectos del estrés social en la memoria probada con una tarea de evitación pasiva. 7. El entorno enriquecido no influye en los efectos del estrés social en los niveles de corticosterona y testosterona. 8. El entorno enriquecido no influye en los efectos del estrés social en la expresión de las células que expresan parvalbúmina y perineuronal nets en el núcleo central de la amygdala. 9. El paradigma de enriquecimiento ambiental aplicado en la adolescencia modula la expresión de PSA-NCAM en el núcleo BM, Me y Ce de la amígdala Conclusiones derivadas del estudio 2. 1. La administración de delta-9-tetrahidrocanabinol durante la adolescencia no modifica la inhibición por prepulso de la respuesta de sobresalto en ratones criados en grupo. 2. La administración de delta-9-tetrahidrocanabinol durante la adolescencia no conduce a cambios en el volumen de corteza infralimbica, prelimbica, cingulada, área 1 y cingulada, área 2. 3. La administración de delta-9-tetrahidrocanabinol durante la adolescencia no induce cambios en la arborización dendrítica o en la densidad de espinas dendríticas de las interneuronas GFP+ de la corteza cingulada en ratones criados en grupo. 4. La administración de delta-9-tetrahidrocannabinol durante la adolescencia no altera el equilibrio excitación-inhibición de las cortezas infralímbica y prelímbica de ratones criados en grupo. 5. La administración de delta-9-tetrahidrocanabinol durante la adolescencia aumenta la densidad de puncta que expresan sinaptofisina alrededor del soma de neuronas piramidales en la capa III de la corteza infralímbica de ratones criados en grupo. 6. La administración de delta-9-tetrahidrocanabinol durante la adolescencia no modifica la densidad de las interneuronas que expresan parvalbúmina, la densidad de las redes perineuronales o su colocalización en las cortezas infralímbica, prelímbica, cingulada, área 1 y cingulada,área 2 de ratones. 7. La administración de delta-9-tetrahidrocanabinol durante la adolescencia no cambia la expresión los ARNm de la ácido glutámico descarboxilasa, isoforma 67, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (ErbB4), la polisialtransferasa ST8 SiaII, la polisialiltransferasa ST8 SIAIV y del receptor canabinoide tipo 1 en ratones socialmente criados . 8. El tratamiento con AM251 durante la edad adulta no revierte los efectos de la administración de delta-9-tetrahidrocanabinol en la densidad de puncta que expresan alrededor del soma de neuronas piramidales en la capa III de la corteza infralimbica de ratones criados en grupo. 9. El tratamiento de AM251 durante la edad adulta, per se, disminuye el porcentaje de la inhibición por prepulso de la respuesta de sobresalto en ratones socialmente criados. 10. La administración de delta-9-tetrahidrocannabinol durante la adolescencia no perjudica la inhibición del prepulso de la respuesta de sobresalto en un modelo de doble impacto de esquizofrenia. 11. La administración de delta-9-tetrahidrocannabinol durante la adolescencia aumenta el volumen de la corteza cingulada área 2 en un modelo de doble impacto de esquizofrenia. 12. La administración de delta-9-tetrahidrocanabinol durante la adolescencia no modifica la arborización dendrítica o la densidad de espinas dendríticas de las interneuronas GFP + de la corteza cingulada en un modelo de doble impacto de esquizofrenia. 13. La administración de delta-9-tetrahidrocanabinol durante la adolescencia no cambia el balance excitación / inhibición en la corteza infralímbica y prelímbica en un modelo de doble impacto de esquizofrenia. 14. La administración de delta-9-tetrahidrocanabinol durante la adolescencia no modula la densidad de puncta del receptor de canabinoides tipo 1 o sinaptofisina que rodea el soma de las neuronas piramidales en la capa III de las cortezas infralímbica y prelímbica en un modelo de doble impacto de esquizofrenia . 15. La administración de delta-9-tetrahidrocanabinol durante la adolescencia disminuye la densidad de las células que expresan la parvalbúmina, la densidad de las redes perineuronales y su colocalización en la corteza prelímbica de un modelo de doble impacto de esquizofrenia. 16. La administración de delta-9-tetrahidrocanabinol durante la adolescencia no cambia la expresión de los ARNm de la ácido glutámico descarboxilasa, isoforma 67, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (ErbB4), la polisialiltransferasa ST8 SiaII, la polisialiltransferasa ST8 SIAIV y los del receptor de canabinoides tipo 1 en un modelo de doble impacto de esquizofrenia. 17. El tratamiento con AM251 durante la edad adulta no revierte los efectos de la administración de delta-9-tetrahidrocanabinol sobre la densidad de las células que expresan parvalbúmina, densidad de las redes perineuronales o su colocalización en la corteza prelímbica de un modelo de doble impacto de esquizofrenia. 18. El tratamiento de AM251 durante la edad adulta aumenta la respuesta de la inhibición por prepulso de la respuesta de sobresalto en un modelo de doble impacto de esquizofrenia. 19. El tratamiento de AM251 durante la edad adulta aumenta el volumen de la corteza cingulada área 1 en un modelo de doble impacto de esquizofrenia. 20. El tratamiento de AM251 durante la edad adulta disminuye la densidad de las células que expresan la parvalbúmina, la densidad de las redes perineuronales y su colocalización en la corteza prelímbica de un modelo de doble impacto de esquizofrenia.