Aplicación de la resonancia magnética nuclear de sistemas paramagnéticos a la determinación de propiedades estructurales y dinámicas de las proteínas rusticianina y calbindina DqK

Resumen

La presente tesis muestra la potencialidad de la Resonancia Magnética Nuclear (RMN) aplicada a sistemas paramagnéticos a la hora de determinar propiedades estructurales, moleculares y dinámicas de los sistemas de estudio. La RMN paramagnética er información en las proximidades del entorno metálico. En esta Tesis se demuestra, sin embargo, que el paramagnetismo en RMN proporciona datos estructurales (derivados de las velocidades de relajación, de los desplazamientos de pseudocontacto y de los acoplamientos dipolares residuales) que compensan y superan la pérdida de información por relajación. Los sistemas de estudio han sido la proteína azul de cobre (BCP) rusticianina (Rc) y la proteína activadora de calcio calbindina D9k (Cb). Rc es la BCP con el mayor potencial redox (680 mV), siendo, asimismo, muy estable a valores de pH extremadamente ácidos. Hemos caracterizado la interacción del metal con sus ligandos mediante estudios de RMN paramagnética tanto del sistema nativo, Cu(II), como del derivado de cobalto(II). La estructura electrónica del ion cobre viene determinada por la interacción de éste con los ligandos histidina, mientras que la interacción del cobre con los ligandos cisteína y metionina es debido al plegamiento global y en las proximidades del entorno metálico de la proteína. La -SgCys es tanto más fuerte cuanto más cerca está el ion metálico del plano NHisNHisSCys formado por los átomos dadores de los ligandos ecuatoriales. El estudio de mutantes de Rc en la metionina axial revelan que aquellos aminoácidos que proporcionan al cobre tetraédrica (mutantes de glutamina, glutamato y cisteína) desplazan al cobre de ese plano y disminuyen la velocidad de autotransferencia electrónica. Mutantes en esta metionina que obligan al cobre a permanecer en dicho plano (leucina) favorecen la velocidad de transferencia electrónica. Por otra parte, hemos constatado en la presente Tesis que el elevado potencial redox de Rc es consecuencia del alto entorno hidrofóbico que rodea al metal. Así mismo, hemos estudiado las características d hidratación de esta proteína mediante RMN heteronuclear 1H-15N. Rc es la más rígida e hidrofóbica entre las BCPs. Estas dos singularidades están relacionadas con su gran estabilidad a bajo pH. El otro sistema con el que hemos trabajado, la proteína Cb, nos ha servido como modelo para determinar la relevancia de las restricciones paramagnéticas en el cálculo de estructuras de proteínas en disolución. El empleo adecuado de estas restricciones nos ha permitido obtener una estructura con una muy buena resolución (la desviación estándar de la familia de estructuras obtenida era 0.25 Å). También hemos realizado estudios de desplegamiento de la proteína en presencia de agente desnaturalizante. En este estado incipiente desnaturalizado, el núcleo hidro compacto, conservando completamente su estructura terciaria. Éste es uno de los factores que influyen en la gran estabilidad de la proteína. Hemos puesto de manifiesto que los iones metálicos son esenciales en la estabilidad estructural de la calbindina D9k. De hecho, hemos relacionado la mayor movilidad de los lazos en ausencia de iones metálicos con pequeños cambios estructurales y con la rotura de interacciones terciarias fundamentales. Estos cambios pueden ser la causa de la disminución drástica de la estabilidad de apo-Cb con respecto a la calbindina metalada. __________________________________________________________________________________________________