Caracterización molecular de un regulador transcripcional del tipo Mga-AtxA en "Enterococcus faecalis"

Laburpena

Enterocococcus faecalis es una bacteria Gram-positiva que se encuentra de forma comensal en el tracto gastrointestinal humano. Sin embargo, como patógeno oportunista puede causar graves enfermedades como bacteriemia y endocarditis. Actualmente, el conocimiento de los mecanismos moleculares que controlan su virulencia es escaso. En general, los reguladores globales que modulan la transcripción de múltiples genes en respuesta a señales ambientales específicas son esenciales en la adaptación de las bacterias patógenas a nichos particulares del hospedador. Mediante búsquedas en las bases de datos, encontramos que el gen EF3013 de E. faecalis V583 codifica una proteína (MAEfa) que tiene similitud de secuencia con los reguladores globales de la familia Mga/AtxA. La estirpe OG1RF también codifica la proteína MAEfa. La familia Mga/AtxA incluye a los reguladores de virulencia AtxA, Mga y MgaSpn de las bacterias Gram-positivas patógenas Bacillus anthracis, Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae, respectivamente. Esta Tesis ha estado centrada en la caracterización funcional de MAEfa. Nuestro objetivo principal ha sido investigar si MAEfa es un nuevo miembro de la familia Mga/AtxA. Con este fin, desarrollamos primero varios vectores plasmídicos: un vector que permite ensayar promotores (pAST), un vector válido para ensayar terminadores de la transcripción (pAS) y dos vectores de expresión (pDLF y pDLS). Todos ellos son útiles tanto para E. faecalis como para S. pneumoniae. A continuación, mediante experimentos de RT-PCR demostramos que hay transcripción del gen maEfa en diferentes estirpes de E. faecalis cuando las bacterias crecen en condiciones de laboratorio estándar. Mediante diferentes aproximaciones in vivo, tales como el uso de fusiones transcripcionales (plásmido pAST-Pma) y experimentos de primer extension, identificamos el promotor del gen maEfa (Pma) y el sitio de inicio de la transcripción, que está localizado a 15 nucleótidos del codón de inicio de la traducción. Utilizando el vector pAS, demostramos que el promotor Pma está precedido por un terminador transcripcional intrínseco. Además, establecimos un protocolo para sobreproducir y purificar la proteína MAEfa. Mediante ensayos de filtración en gel y experimentos de ultracentrifugación analítica, demostramos que MAEfa forma dímeros en solución. Estudiamos la interacción de MAEfa con DNA lineal de cadena doble mediante ensayos de retraso en gel y experimentos de protección frente a la digestión con DNasa I. Nuestros resultados demuestran que MAEfa genera complejos multiméricos sobre DNA lineal de cadena doble y que no parece reconocer una secuencia nucleotídica específica cuando interacciona con dicho DNA. La proteína MAEfa-His también forma múltiples complejos proteína-DNA. Además, MAEfa reconoce un sitio localizado upstream del promotor Pma. Este sitio contiene una curvatura intrínseca potencial. Para investigar si MAEfa funciona como un regulador global, construimos un derivado de OG1RF que carece del gen maEfa. Mediante análisis de microarrays, RT-PCR cuantitativa y estudios de complementación, mostramos que MAEfa influye positivamente en la transcripción de numerosos genes. Muchos de ellos codifican componentes de transportadores PTS, componentes de transportadores ABC y proteínas implicadas en el metabolismo de fuentes de carbono. Asociado a este hecho, el crecimiento de la estirpe mutante de deleción está afectado en medios de cultivo que contienen glicerol, maltosa o manitol. Estudiamos también el papel de MAEfa en virulencia bajo la supervisión del Dr. Oliver Goldmann. Empleando un modelo de peritonitis murina observamos que la estirpe mutante de deleción induce una inflamación menor en la cavidad peritoneal. Nuestros resultados sugieren que MAEfa facilita la adaptación de E. faecalis a nichos específicos del hospedador controlando la transcripción de numerosos genes y, en consecuencia, contribuye a su posible virulencia.