Estudis bioquímics i estructurals de diferents formes de nucleoplasmina. Interacció amb histones i altres proteïnes bàsiques.

Zusammenfassung

La nucleoplasmina (NP) és la proteïna majoritària del nucli dels oòcits i ous no fecundats de la granota Xenopus laevis i altres amfibis. Es tracta duna proteïna acídica amb tres trams acídics principals (A1, A2, A3). La NP participa en la remodelació de la cromatina durant la fecundació, mediatitzant la descondensació de la cromatina espermàtica i facilitant lacoblament de nucleosomes gràcies a la seva funció de xaperona molecular. En el decurs daquest treball sha continuat lestudi dels diferents recombinants de la NP de què disposem, posant especial èmfasi en la forma mutant r-NP142, que es caracteritza pel fet que té el tram acídic principal A2 molt exposat. Interessava determinar la influència de diferents condicions en lestabilitat i el grau de pentamerització de la molècula. En aquesta mateixa línia es va estudiar el paper de les Cys de la NP en la pentamerització. Mitjançant mutagènesi dirigida es van substituir les Cys per Ser i es va observar que concretament la mutació de la Cys 45 afavoria la monomerització de la forma r-NP142, però no afectava loligomerització de les formes r-NP i r-NP121, les quals romanien pentamèriques. Aquests resultats suggereixen que no hi hauria ponts disofre en lestructura pentamèrica de la nucleoplasmina. La caracterització estructural de la nucleoplasmina es va intentar abordar a diferents nivells. A nivell de lestructura secundària, es van utilitzar tècniques de dicroisme circular. Concretament es va determinar que el mutant r-NP142 C45S tenia una estructura plegada a latzar (random coil). Daltra banda, per a ordres estructurals superiors es van utilitzar tècniques de microscòpia electrònica i tècniques cristallogràfiques. Un altre objectiu daquest treball va ser la caracterització de les interaccions de lNP amb histones del nucli del nucleosoma. Estàvem especialment interessats a veure si la interacció NP-histones era fonamentalment de tipus electrostàtic o bé podria tractar-se dalgun altre tipus dinteracció. Mitjançant ultracentrifugació analítica i gradients de sacarosa es va poder determinar que la NP podia unir els quatre tipus dhistones nucleosòmiques. Aquesta unió tindria una estequiometria corresponent a 1 mol de pentàmer de NP per mol doctàmer dhistones. Cal destacar que la NP pot unir també histones tripsinitzades (sense les cues bàsiques) mantenint la mateixa estequiometria que per al cas de les histones natives. Així mateix, la forma r-NP121 (sense el tram acídic A2) és capaç dunir histones natives amb la mateixa estequiometria descrita per als casos anteriors. Aquests experiments indiquen que la interacció NP-histones no seria predominantment electrostàtica. Un altra línia de treball va ser estudiar la presència o no duna NP-like a lextracte doòcits de lestrella de mar Echinaster sepositus. Sha trobat una proteïna majoritària que presenta les propietats de ser termoestable, acídica i parcialment resistent al sulfat amònic. Aquesta proteïna és reconeguda pels anticossos policlonals antinucleoplasmina obtinguts en ous de gallina. Daltra banda, no és capaç de descondensar nuclis espermàtics que contenen protamina. El darrer objectiu del treball va ser lestudi estructural de la proteïna ?0. La ?0 és específica del nucli espermàtic de lequinoderm Holothuria tubulosa i presenta propietats intermèdies entre les protamines i les histones. La cristallització duna molècula daquestes característiques aportaria informació sobre lestructura de les proteïnes que participen en la compactació de la cromatina i podria obrir un nou camí per a la cristallització de les protamines i dels complexos NP-protamina. -------------------------------------------------------------------------------------------------------