Regulación de la señalización no canónica por el receptor de melanocortinas 1 humano

Résumé

El receptor de melanocortinas 1 (MC1R), expresado en melanocitos epidérmicos, es el principal determinante de las respuestas biológicas cutáneas a la radiación ultravioleta. La señalización por MC1R mejor conocida transcurre por las vías del AMPc y de las MAP quinasas ERK1/2, y está regulada por mecanismos comunes a todos los GPCRs, pero también por mecanismos no canónicos como la modulación por variantes alélicas del gen MC1R o la participación de proteínas accesorias como mahogunina (MGRN1), una proteína con actividad E3-ubiquitina ligasa que compite con la proteína Gs por su unión a MC1R. La mutación mahoganoide, que inactiva el gen murino Mgrn1, genera ratones de pelaje oscuro con alta letalidad embrionaria y propensión al desarrollo de cardiopatías y encefalopatía espongiforme. Con estos antecedentes, en este trabajo nos propusimos estudiar: a) la funcionalidad de variantes alélicas del gen MC1R asociadas a fenotipos de pigmentación humana y b) el papel de MGRN1 en la pigmentación melánica. Se caracterizó la función de mutantes naturales identificados en una población pakistaní con fenotipo de hipopigmentación: una truncación prematura (p.Y298*) y una variante por deleción de un triplete (p.V174del). Ambos mutantes presentaron estabilidad y tráfico intracelular alterados, con notable retención en compartimentos intracelulares y menor expresión en la membrana. Además, p.Y298* fue incapaz de unir agonistas, mientras que p.V174del mostró alta afinidad por los mismos. Consecuentemente, ambas formas presentan pérdida de acoplamiento a la cascada del AMPc, parcial para p.V174del y total para p.Y298*, que explicaría el fenotipo de pigmentación asociado. El papel de MGRN1 en la pigmentación melánica se analizó en líneas celulares de melanocitos murinos control (melan-a6) y nulos para el gen Mgrn1 (melan-md1), en clones de células melan-a6 y de B16F10 nulos para Mgrn1 obtenidos mediante tecnología CRISPR/Cas9, y en células de melanoma humano tras represión de MGRN1 mediante siRNA. La pérdida de expresión de Mgrn1 en melanocitos condujo a un fenotipo más diferenciado, con incremento del número de dendritas y contenido en melaninas. A nivel ultraestructural, las células Mgrn1-KO presentaron mayor número de melanosomas total y en estadios maduros. La ausencia de Mgrn1 también aumentó la actividad de la enzima tirosinasa medida in vivo, pero no la cantidad de mensajero o proteína ni la capacidad catalítica in vitro. Esta activación de tirosinasa in situ se debió al aumento del pH del melanosoma detectable mediante tinción de orgánulos ácidos con DAMP o AO. La sobreexpresión de Mgrn1 acidificó los orgánulos relacionados con lisosomas (LRO) en células HEK293T y disminuyó la actividad de tirosinasa expresada ectópicamente. Todo ello sugiere que Mgrn1 es un regulador del pH de orgánulos del linaje lisosomal aún no caracterizado, que contribuye a la biogénesis, maduración y transporte de los melanosomas y a la regulación del pH del lumen de dichos orgánulos. Además, puesto que estos resultados se confirmaron en un sistema heterólogo mediante transfección transitoria, esta función de Mgrn1 como regulador del pH no estaría restringida a los melanocitos, sino que sería extensible a los LRO de otros tipos celulares. La comparación de los perfiles de expresión génica en células melan-a6 y melan-md1 confirmó el papel de Mgrn1 en la regulación del pH y apuntó a Mcoln3, Atp6v0d2 y Ctns como genes sobreexpresados en células melan-md1 potencialmente relacionados con ese proceso. Comprobamos la inducción de dichos genes en células melan-a6 tras silenciamiento de Mgrn1 mediante CRISPR/Cas9 o tras tratamiento con siRNA específicos. Experimentos de validación funcional indicaron que Mcoln3 es un mediador del efecto de Mgrn1 en el pH del melanosoma, ya que el silenciamiento de su expresión en células melan-md1 produce una disminución de la actividad tirosinasa y del pH de los melanosomas, estimado mediante la sonda DAMP.