Biomolecular Characterization of PCNA interacting proteins

Résumé

PCNA (Proliferating Cellular Nuclear Antigen) es la abrazadera que es desliza sobre el ADN necesaria para la replicación del ADN y la respuesta al daño. PCNA interactúa con numerosas proteínas a través de una secuencia conservada y conocida como motivo PIP. Resultados del laboratorio identificaron PCNA como una de las 10 principales proteínas que interactúan con la enzima desubicuitinasa (DUB) USP29 y hemos descubierto que la expresión de USP29 disminuye la poli-ubicuitinación de PCNA en respuesta a un estrés genotóxico y que esta des-poli-ubicuitinación depende de la actividad catalítica de USP29. Los diferentes intentos realizados para purificar la proteína USP29 resultaron infructuosos. Usando péptidos sintéticos como modelo, hemos determinado que la interacción con PCNA no ocurre a través de ninguno de los motivos PIP identificados en la secuencia USP29. En cambio, los ensayos de co-inmunoprecipitación mostraron que el dominio PH (Pleckstrin Homology) del extremo N-terminal de USP29 interactúa con PCNA, aunque no tiene un motivo PIP. La purificación del dominio PH no tuvo éxito. Descubrimos que USP29 forma dímeros/oligómeros a través del dominio PH y dicha dimerización es necesaria para la actividad de USP29 como DUB. La ADN polimerasa ¿ es la encargada de replicar la cadena rezagada del ADN a través de su unión con PCNA. PCNA interactúa con todas las subunidades de Pol ¿, pero solo la interacción con p68 y p12 se ha caracterizado estructuralmente. En esta tesis, los análisis basados en RMN y calorimetría isotérmica de la interacción p125-PCNA han identificado que el fragmento C-terminal de la subunidad catalítica de la polimerasa humana ¿ (p125996-1009) se une PCNA a través de un motivo PIP no canónico, con una constante de disociación de 103 ± 14 ¿M at 37 °C.