Synthesiomyia nudiseta (diptera muscidae) y su importancia en entomología forense e investigación aplicada

Zusammenfassung

INTRODUCCION La Entomología Forense es la disciplina encargada del estudio de cualquier aspecto relacionado con los insectos y otros artrópodos, con el propósito de obtener información útil para las investigaciones legales. Incluye varios ámbitos de aplicación, siendo el medicolegal (artrópodos asociados a investigaciones de tipo criminal) en el que está centrado este proyecto. Los inicios históricos de la Entomología Forense en Europa se remontan a finales del siglo XIX. En particular las monografías del Dr. Mégnin (1894) determinaron que los artrópodos están asociados a los cadáveres de forma selectiva y en un orden preciso; estas oleadas de colonización aportarían información útil para el cálculo del tiempo transcurrido desde la muerte. Sin embargo, con el desarrollo científico de la Medicina Legal la aplicación de la entomología en este ámbito declinó hasta los años 60 del pasado siglo. En España la investigación en este área, ha sido escasa y muy puntual (Magaña, 2001). Los principales trabajos abarcan aspectos relacionados con la ecología de la comunidad sarcosaprófaga (ej.: Castillo (2002), Arnaldos et al., (2001, 2004)). Son más numerosos los trabajos de investigación básica sobre dípteros sarcosaprófagos (p. ej.: Martínez-Sánchez, et al., 2001; Romera et al., 2003; Martínez-Sánchez, et al., 2007a; 2007b; 2007c; Gobbi et al, 2007; Velásquez et al., 2008). De manera general la investigación en entomología forense en España se ha incrementado considerablemente en los últimos 20 años. Sin embargo son muchos los aspectos, tanto en lo referente a investigación básica como aplicada que faltan por estudiar. Synthesiomyia nudiseta (Van der Wulp, 1883) es un múscido de origen tropical y subtropical, siendo la única especie conocida del género Synthesiomyia Brauer & Bergenstamm, 1893 (Muscidae: Azeliinae: Reinwardtiini). Su importancia reside en su utilización como indicador forense para la estimación del intervalo postmortem, por lo que ha sido usada en investigaciones legales en diferentes lugares del mundo, como Costa Rica, India, Malasia, Tailandia y Estados Unidos. Fuera de su área de origen, esta especie ha sido detectada fundamentalmente en territorios insulares como Malta, Madeira, Canarias o las islas Azores (Pont, 1986; Ebejer & Gatt, 1999). En el continente europeo, fue citada por vez primera a partir de muestras obtenidas durante los años 1996 y 1997 en Marbella (Málaga) y en dos pequeños islotes cercanos a la costa de Alicante (Bowden, 1997; Martínez-Sánchez et al., 2005). A partir de esa fecha, su presencia en España es mas notoria apareciendo con relativa frecuencia en varias autopsias en el sureste y centro de nuestro país (Velásquez et al., 2013). Por todos estos motivos, el estudio de la biología de S. nudiseta es de vital importancia para su correcta aplicación en el ámbito forense en España y Europa, constituyendo el principal objetivo de esta tesis doctoral. DESARROLLO Las tareas a desarrollar relacionadas con los objetivos propuestos son las siguientes: Tarea 1: Estudiar el desarrollo de S. nudiseta en condiciones controladas para generar las curvas de crecimiento que permitan calcular la datación de las etapas de su desarrollo preimaginal. Se desarrollarán curvas de crecimiento a varias temperaturas (15, 20, 25 y 30ºC, HR 60-70% y L: D 12:12). A partir de pies de colonias, los huevos o larvas serán colectados a las 3 horas de la puesta, utilizando como sustrato pescado. Cerca de 100 huevos/larvas serán transferidos a un envase con 200g de hígado de cerdo, y este a su vez, a otro cubierto con malla y con arena en el fondo para facilitar la pupación. Este procedimiento se repetirá 10 veces. Los recipientes de cría se mantendrán en una cámara de crecimiento con las condiciones anteriormente mencionadas. Posteriormente, cada 24 horas cinco de las larvas más grandes deben de ser recolectadas de cada envase hasta que las primeras 5 larvas comiencen a pupar en cada envase. Los individuos recolectados deben ser introducidos en agua caliente 70-80ºC, durante 5 minutos aproximadamente. Finalmente se preservarán en alcohol al 70%. Para construir las curvas de crecimiento, se evaluará el promedio de la longitud máxima de las 50 larvas medidas diariamente frente al tiempo. Para determinar la duración de los estados larvarios, cada día se estudiarán las aberturas de los espiráculos posteriores de los 5 individuos de mayor tamaño en cada envase. Se aplicará como duración mínima de cada estado el promedio de cada envase. Se examinarán un total de 10 réplicas. En el análisis de estos datos se plantean dos métodos para la obtención de resultados que permitan la estimación de la edad de las evidencias entomológicas. Tarea 2: Evaluar la interacción de S. nudiseta con las principales especies de dípteros con importancia forense en el área de estudio y determinar los efectos de la competencia intra e interespecífica. Para este objetivo, se procederá al establecimiento de colonias en condiciones controladas de laboratorio para la recolección de muestras de los diferentes estados de desarrollo (huevo, larvas, pupas y adultos). Una vez establecidas las colonias las larvas neonatas (edad ± 2 horas) se dispondrán en viales conteniendo hígado de cerdo. Cuando las larvas del último estadio dejen de alimentarse se les permitirá su acceso a una zona con serrín donde se realizará la pupación.. En el momento que se observa la presencia de adultos, se anotará la fecha, quedando atrapados en el recipiente. Posteriormente se espera a que todos los imagos emerjan y extiendan las alas, para posteriormente congelarlos, contabilizar el número de imagos de cada sexo y registrar su tamaño alar. En primer lugar se realizaran experimentos dirigidos a estudiar la competencia larvaria entre individuos de la misma especie, para posteriormente ser utilizados como control a la hora de analizar cuáles son las repercusiones de la presencia de dos especies en un mismo medio. Las especies seleccionadas para estudiar la interacción con S. nudiseta serán los califóridos Chrysomya albiceps, Lucilia sericata y Calliphora vicina. Se realizarán experimentos en los que grupos mixtos serán criados en densidades de 50, 100, 150 y 300 larvas de cada especie y cultivos puros de 25, 50, 75, 100, 150, 300. Tarea 3: Caracterización morfológica y química de las glándulas salivares de las larvas de S. nudiseta. Una vez se obtengan los huevos, las larvas de primer estadio se criarán con hígado de cerdo ad libitum hasta que alcancen el estadio tres y estas migren a un sustrato arenoso para pupar. Después de 24 horas en este medio, éstas se recogerán y se dejarán en una cámara fría a 5ºC para que no lleguen a pupar y tener las glándulas listas. La obtención de las glándulas salivares se realizará mediante una microdisección in vivo, tras un golpe de frío, justo por detrás del esqueleto cefalofaríngeo (entre el tercer segmento torácico y primer segmento abdominal). Para la caracterización morfológica de las glándulas salivares se realizarán fotografías con microscopio electrónico de barrido (SEM) y lupa binocular. Para averiguar la fuerza de adhesión que tiene la sustancia de las glándulas salivares se realizarán pruebas de cizallamiento con lienzo. En la caracterización química de las glándulas salivares se analizarán las proteínas de nuestra muestra mediante la espectrometría de masas HPLC-MS/MS y los grupos moleculares de nuestra sustancia mediante su espectro infrarrojo. Todo el instrumental utilizado está presente en los Servicios Técnicos de Investigación (SSTTI) de la Universidad de Alicante y se colaborará con el grupo de investigación Laboratorio de Adhesión del Departamento de Química Inorgánica de la Universidad de Alicante coordinado por el Dr. José Miguel Martín Martínez. Tarea 4: Desarrollo de una herramienta informática que facilite el empleo de las evidencias entomológicas en las investigaciones forenses. La creación de esta herramienta informática se realizará en dos fases. En primer lugar, se creará una base de datos en la que se podrá incluir la información de cada una de las especies con importancia forense (fotos de los estadios larvarios, temperatura basal, curvas de crecimiento, duración del desarrollo preimaginal etc.). También está previsto puedan incluirse datos de casos forenses reales. Posteriormente, se desarrollará la aplicación para el cálculo del IPM (intervalo post-morten), mediante la utilización de los datos introducidos en la base de datos, dependiendo de factores como la temperatura del sitio donde ha aparecido el cadáver o el lugar. Para dar soporte a estas fases, se utilizará una plataforma que permitirá introducir y modificar los datos forenses de distintas especies y además calculará el IPM de manera automatizada. El objetivo es que esta aplicación informática pueda ser accesible vía online, por lo que se realizará con el uso de tecnologías web. Su uso podrá ser abierto o restringido en función de las necesidades o la naturaleza de los datos tratados. En este estudio se colaborará con el grupo de investigación Robótica y Visión Tridimensional perteneciente al Instituto de Investigación Informática de la Universidad de Alicante coordinado por el Dr. Miguel Cazorla. Todo el desarrollo de la aplicación se llevará a cabo bajo la supervisión de la autora de esta memoria, incorporando el conocimiento necesario para establecer los elementos tanto de diseño como de funcionamiento de la herramienta. CONCLUSIÓN Se obtiene un conjunto específico y novedoso de conocimientos sobre el desarrollo larvario de Synthesiomyia nudiseta en nuestro país pero que tiene gran interés a nivel europeo, debido en parte a la escasez de estudios sobre la peculiar y heterogénea entomofauna española y a la dificultad del cálculo del cronotanatodiagnóstico basado en evidencias entomológicas en el ámbito profesional (policial y médico-legal). Las aportaciones de este trabajo facilitan la estimación eficaz y realista del IPM y otros factores que influyen en su cálculo en procesos legales, en particular en aquellos donde esté implicada esta especie.