Purificación parcial y caracterización de una colesterol ester hidrolasa de microsomas de hígado de rata

Résumé

SE HA PURIFICADO UNA COLESTEROL ESTER HIDROLASA (CEH) DE MICROSOMAS DE HIGADO DE RATA EN SIETE ETAPAS. LA SOLUBILIZACION OPTIMA DE LA ACTIVIDAD SE PUEDE LLEVAR A CABO MEDIANTE DOS PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS: ULTASONACION O TRATAMIENTO DE LAS MEMBRANAS CON EL DETERGENTE NO IONICO N-OCTIL BETA-D-GLUCOPIRANOSIDO (OG). LA ULTASONACION PERMITE LA SOLUILIZACION DE LA ACTIVIDAD CEH PRESENTE EN 100MG DE PROTEINA MICROSOMAL EN MENOS DE 8 MIN RECUPERANDO EL 95% DE LA ACTIVIDAD CEH EN EL 34% DE LA PROTEINA. EL 100% DE LA ACTIVIDAD CEH ASOCIADA AL 42% DE LAS PROTEINAS SE SOLUBILIZA TAMBIEN TRATANDO LOS MICROSOMAS CON EL DETERGENTE OG A CONCENTRACION 30 MM MANTENIENDO EN 4 LA PROPORCION EN PESO ENTRE DETERGENTE Y PROTEINA. LA ACTIVIDAD CEH DE MICROSOMAS DE HIGADO DE RATA SE PURIFICA EN LAS SIGUIENTES ETAPAS: SEPARACION DE MEMBRANAS MICROSOMALES POR FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR, LAVADO DE MEMBRANAS, SOLUBILIZACION POR ULTRASONACION, PRECIPITACION AL 7% (P/V) DE PEG, ACLARAMIENTO CON CRISTALES DE HIDROXIAPATITOAL AL 0,1% (P/V), CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO EN COLUMNAS HITRAP Q Y CROMOGRAFIA EN HIDROXIAPATITO. EL PODER MAS RESOLUTIVO DE ESTA PURIFICACION RECAE SOBRE LA ETAPA DE INTERCAMBIO IONICO, GRACIAS A LA UTILIZACION DE UN INUSUAL PROCESO DE ELUCION, EN EL QUE SE APLICAN ESCALONES DE FUERZA IONICA CRECIENTE PARTIENDO EN CADA CASO DESDE EL 0% DEL ELUYENTE SALINO. DADA LA MARCADA INESTABILIDAD DE LA MUESTRA PURIFICADA, EL RENDIMIENTO ERA DEL 3,21% Y EL FACTOR DE PURIFICACION DE 12,4 VECES Y REPRESENTANBA EL 0,25% DE LA PROTEINA MICROSOMAL DE PARTIDA. EL SEGUIMIENTO DE LAS ACTIVIDADES TRIGLICERIDO LIPASA (TGL) Y ESTERASA INESPECIFICA (EL) A LO LARGO DE LA PURIFICACION REFLEJABAN QUE LA ACTIVIDAD CEH HABIA SIDO PURIFICADA 141 VECES RESPECTO A LA EL Y 55,8 VECES RESPECTO A LA TGL. LA CARACTERIZACION DE LA ACTIVIDAD CEH PURIFICADA REFLEJA QUE COMPARTE CARACTERISTICAS PROPIAS DE LAS CEH DE HIGADO, COMO UNA MASA MOLECULAR EN TORNO A 65