Design and synthesis of novel topoisomerase I Inhibitors. 1,5-Naphthyridine derivatives with antiproliferative activity

Résumé

El trabajo de investigación que se recoge en la presente memoria se ha centradoen el diseño y la síntesis de derivados de 1,5-naftiridinas con posible actividadbiológica como inhibidores de topoisomerasa I (TopI). La TopI es una enzimamonomérica que no necesita ATP para su funcionamiento y ha adquirido gran interésen los últimos en años como diana en la terapia contra el cáncer. Esta enzima juega unpapel fundamental en el control estructural del ADN en las células, liberando la tensiónproducida en la replicación, transcripción y recombinación. Para minimizar estatensión, la TopI divide de forma transitoria una de las hebras del ADN mediante elataque nucleofílico del grupo hidroxilo del residuo de tirosina723 del sitio activo algrupo fosfodiester de la cadena de ADN formando un complejo covalente entre la TopIy el ADN (Figura 1). Tras un segundo ataque nucleofílico se libera la enzima funcionallista para otro ciclo enzimático.Figura 1. Ruptura del ADN por la TopI.La acción de la TopI puede ser inhibida a diferentes niveles del ciclo catalítco;evitando la unión TopI-ADN, impidiendo el primer ataque nucleofílico, estabilizando elcomplejo covalente o inhibiendo el proceso de religación (segundo ataquenucleofílico). De esta forma los inhibidores de TopI se denominan venenos cuandoimpiden el proceso de religación y únicamente se les denomina inhibidores cuandoevitan el primer ataque nucleófilo. Los venenos son inhibidores interesantes desde elpunto de vista clínico y uno de los venenos de referencia de TopI es la camptotecina2(CPT, Figure 2) aunque presenta ciertas limitaciones como son baja solubilidad enagua, hidrólisis del anillo de lactona (E) a pH fisiológico, resistencia a algunas célulascancerosas y la reversibilidad del complejo covalente ADN-TopI-CPT.Figura 2. Estructura de la camtotecina.Debido a estas limitaciones son muchas las modificaciones que se han realizadoen la estructura de CPT para intentar eliminar estas desventajas. Además se hansintetizado otros inhibidores, no derivados de CPT, que también actúan comoinhibidores de TopI, la estructura más conocidas suelen ser sistemas quinolinicos eisoquinolinicos con ciertas características comunes como la pseudo planaridad y elfragmento de indenona.3ObjetivosLos compuestos heteroaromáticos planos, son particularmente efectivos comoinhibidores de TopI, ya que se intercalan entre las bases del ADN y se orientanmediante interacciones de tipo ¿-¿ stacking, logrando la estabilización del complejoTop1-ADN, evitando la relajación y provocando la muerte celular. Con estos y otrosantecedentes, en esta memoria nos propusimos abordar la síntesis de derivados de1,5-naftiridinas (Figura 2) con posible actividad biológica y que carezcan de laslimitaciones que presenta la camptotecina.Figure 2.Derivados policíclicos de 1,5-naftiridinasAsí mismo, nos propusimos estudiar el efecto inhibitorio de los compuestossintetizados frente a la topoisomerasa I y su efecto citotóxico en tres líneas celularesde cáncer (A549, BT20 y SKOV3).4ResultadosPara llevar a cabo la síntesis de estos compuestos utilizamos la metodología dePovarov, ya que es una ruta sintética muy eficaz para la síntesis de heterociclos. Estaestrategia ya ha sido previamente utilizada para la síntesis de compuestosbiológicamente activos como martinelina, camptotecina o luotonina A.La reacción de Povarov, que fue descrita en 1963 por primera vez, es un tipo dereacción hetero Diels-Alder que consiste en la reacción ¿one pot¿ entre arilaldiminasderivadas de la condensación de anilina con aldehidos aromaticos, y olefinas ricas enelectrones en presencia de trifluoruro de boro como catalizador para obtener lascorrespondientes tetrahidroquinolinas (Esquema 1).Esquema 1. Reacción de Povarov.En nuestro caso, la utilización de 3-aminopiridina en vez de anilina como aminade partida nos ha permitido la obtención de derivados de 1,5-naftiridinas (Esquema 2).Esquema 2. Reacción de Povarov con olefinas.5La cicloadición [4+2] entre iminas derivadas de 3-aminopiridinas y diferentesaldehídos aromáticos 3 con indeno en presencia de BF3·Et2O, transcurre vía estados detransición endo y permite la preparación de derivados de tetrahidro-7H-indeno-[2,1-c][1,5]-naftiridinas 6 con control regio- y estereoselectivo de tres estereocentros(Esquema 2). Los mismos compuestos pueden prepararse mediante una reacciónmulticomponente. Debido a la importancia de la planaridad de los compuestos, hemosllevado a cabo la deshidrogenación de las tetrahidronaftiridinas 6 con DDQ paraobtener las 7H-indeno-[2,1-c][1,5]-naftiridinas 7 correspondientes, las cuales puedenser transformadas en los correspondientes derivados carbonilicos 7H-indeno-[1,5]-naphthyridin-7-ones 8 con acetato de manganeso. Finalmente, con el fin de aumentar ladiversidad molecular y estudiar el posible efecto biológico de la transformación, se hareducido el grupo carbonilo a hidroxilo con NaBH4.Además, hemos llevado a cabo la reacción de Povarov de iminas derivadas de 3-aminopiridina y aldehídos aromáticos 3 con acetilenos 10 como dienófilos, utilizandoBF3·Et2O como ácido de Lewis, obteniendo las correspondientes 1,5-naftridinas 11 conbuenos rendimientos (Esquema 3).Esquema 3. Reacción de Povarov con acetilenos.Finalmente y con el objetivo de evaluar el comportamiento de los derivados de1,5-naftiridinas como inhibidores de de TopI se han llevado a cabo ensayos deinhibición enzimática y ensayos in vitro de su actividad citotóxica en tres líneascelulares de cáncer (A549, BT20 y SKOV3).La evaluación de la inhibición enzimática se llevó a cabo realizando unexperimento de relajación del ADN superenrollado (pUc18) por acción de la TopI enpresencia de los derivados sintetizados. Estas reacciones enzimáticas se resuelvenutilizando la técnica de electroforesis en gel de agarosa. De esta forma, hemosobservado que los derivados de indeno-1,5-naftiridians 6, 7, 8, 9 y 10 actúan comoinhibidores de TopI y cuando se preincuba el compuesto con la enzima el efectoinhibitorio es mayor que en el caso del inhibidor de referencia, la CPT. Del mismo6modo se estudió la inhibición de los derivados 11 observándose diferentes grados de inhibición dependiendo de los sustituyentes presentes en la molécula. La sustitución meta en el anillo aromático en la posición 2 del esqueleto de naftiridina tiene un efecto positivo en términos de inhibición. Cuando la molécula presenta un grupo bifenilo en la posición 4, las 1,5 naftiridinas 11 muestran inhibición completa superior al efecto que presenta la CPT. En cuanto a los experimentos de citotoxicidad, estos se han llevado a cabo en tres líneas celulares diferentes, BT20 (cáncer de mama), A549 (adenocarcinoma de pulmón) y SKOV3 (cáncer de ovario). Se han obtenido algunos valores de citotoxicidad interesantes para algunos de los derivados sintetizados. Así la tetrahidronaftiridina con R= 2,4-F2-C6H4, con dos átomos de fluor en su estructura presenta un IC50= 6.4±0.1 ¿M. Además la correspondiente forma deshidrogenada presenta un valor de IC50= 1.7±0.1 ¿M en la línea de cáncer de pulmón (A549) y un valor de IC50= 6.4±0.3 ¿M en la línea de cáncer de ovario (SKOV3). De los derivados carbonílicos, el derivado con R=2-Naftil presenta un valor de IC50= 0.8±0.2 ¿M, siendo el mejor valor de citotoxicidad obtenido. De la misma forma, las 1,5-naftiridinas 11 fueron estudiadas en las mismas líneas celulares. El mejor valor de citotoxicidad lo encontramos para el derivado que presenta un grupo 4-NO2-C6H4 en la posición 2 y un grupo fenilo en la posición 4 en la línea de cáncer de pulmón con IC50= 1.9±0.4 ¿M y IC50= 3.9±0.3 ¿M. Los derivados 11 con un átomo de fluor en posición para también mostraron buenos resultados de citotoxicidad con IC50 entre 2.8 y 9.2 ¿M. Además se ha observado que la sustitución meta en los aldehídos aromáticos tiene un efecto positivo desde el punto de vista de inhibición de TopI y efecto citotóxico. Algunos de los compuestos más citotóxicos fueron evaluados en una línea sana de pulmón (MCR), demostrando que aunque impiden la proliferación de las células de cáncer apenas afectan al crecimiento de células sanas