Sustitución del gen nirA entre cianobacterias termofílicas. Clonación, expresión y purificación de la nitrito reductasa de Thermosynechococcus elongatus BP-1

Résumé

Las cianobacterias son organismos procariotas, Gram-negativos que se caracterizan por llevar a cabo la fotosíntesis oxigénica. Constituyen un grupo muy heterogéneo pero en todas ellas el nitrógeno representa un alto porcentaje de su peso seco. El nitrógeno puede ser asimilado de distintas formas. En el caso de Phormidium laminosum y Thermosynechococcus elongatus BP-1, el nitrógeno entra en las células como amonio, nitrato y nitrito. P. laminosum y T. elongatus BP-1 son dos cianobacterias que poseen una organización similar de los genes responsables de la toma y asimilación de nitrato/nitrito. En este trabajo se ha sustituido el gen que codifica la nitrito reductasa de T. elongatus BP-1 (primer gen de este operón) por el correspondiente de P. laminosum. Para realizar el proceso se ha empleado la técnica Long Flanking Homology-PCR (LFH-PCR) y la capacidad que muestra T. elongatus BP-1 para adquirir DNA exógeno de forma natural. De esta manera, a lo largo del desarrollo, se han obtenido dos tipos celulares distintos. En primer lugar, se han construido células de T. elongatus BP-1 carentes del gen nirA, y posteriormente, células de T. elongatus BP-1 complementadas con nirA de P. laminosum Además, con el objetivo de estudiar el metabolismo del nitrógeno de T. elongatus BP1, se ha clonado, expresado y purificado la proteína NirA, que codifica la actividad nitrito reductasa, comprobándose que en esta proteína existe una zona especialmente susceptible a la hidrólisis o accesible a las proteasas. Finalmente se han obtenido anticuerpos policlonales anti-NirA, que han permitido hacer un seguimiento detallado in vivo de la expresión de la proteína NirA en células silvestres de T. elongatus BP-1.