Alfa-hemolisina de E.colipurificación, propiedades, mutagénesis y estudio de su exportación mediante fusiones génicas

Résumé

EN EL TRABAJO SE OBTUVIERON UNOS MUTANTES EN LA SECUENCIA DE LA PROTEINA HL Y A SE ESTUDIO COMO ESTAS MUTACIONES AFECTABAN A LA ACTIVIDAD Y A LA EXPORTACION AL EXTERIOR CELULAR DE LA PROTEINA HLY A. COMPROBANDOSE QUE EFECTIVAMENTE LA ZONA HIDROFOBICAS LOCALIZADAS EN LA MITAD N-TERMINAL DE LA PROTEINA DEBEN ESTAR INVOLUCRADAS EN LA ACTIVIDAD DE LA MISMA Y PROBABLEMENTE LA ZONA CENTRAL ESTE RELACIONADA CON LA ESTABILIDAD O LA ACTIVIDAD. SE OBTUVO UNA MUESTRA PURIFICADA DE LA TOXINA Y SE CARACTERIZO BIOQUIMICAMENTE OBTENIENDOSE UN PUNTO ISOELECTRICO DE 4,3, UN TAMAÑO DE PARTICULA DE MAS DE 100MM Y SE COMPROBO QUE ESTABA COMPUESTA POR UN 70% DE PROTEINA, UNA 30% DE CARBOHIDRATO, Y UN 0,05% DE FOSFORO ASOCIADO A LA FASE LIPIDICA. LAS MEDIDAS DE KDO Y ACIDO BETA-HIDROXIMIRISTICO PRESENTES EN LA MUESTRA CONFIRMABAN QUE EL CARBOHIDRATO DE LA MISMA PROVENIA EN SU TOTALIDAD DEL LIPOPOLISACARIDO DE LA PARED BACTERIANA. FINALMENTE SE OBTUVIERON UNAS FUSIONES ENTRE LA CAT (CLORANFENICOL ACETILTRANSFERASA) DEL TN 9, LA AMINOGLICOSIDO 3 FOSFOTRANSFERASA DEL TN 5, LA DIHIDROFELATO REDUCTASA DE R388 Y HLY C CON FRAGMENTOS DE 19 AA, 89 AA, 145 AA, 194 AA Y 397 AA DEL EXTREMO C-TERMINAL DE HLY A; OBSERVANDOSE QUE SOLO EN EL CASO DE LA FUSION HLY C-194 AA C-TERMINAL HLY A EXISTIA UN CIERTO NIVEL DE TRANSPORTE AL EXTERIOR CELULAR.