La conformación de glicomiméticos en su estado libre en disolución y asociados a sus receptores una visión 3D utilizando RMN

Zusammenfassung

INTRODUCCIÓN%&/Las interacciones carbohidrato proteína se ven envueltas en un amplio rango de mecanismos biológicos, comenzando con la fertilización y extendiéndose a diversas patologías como el desarrollo tumoral. También median en diversas actividades celulares, incluyendo el reconocimiento celular, el control del crecimiento y la apoptosis. Es obvio que un detallado conocimiento de de la estructura y dinámica de los carbohidratos, tanto libres como unidos a proteínas, es relevante.%&/Para ello la RMN ha sido aplicada a este campo ya que puede proporcionar información conformacional y dinámica. Debido a las características de los carbohidratos, especialmente a la flexibilidad, los parámetros de RMN deben complementarse con cálculos computacionales, normalmente, de mecánica o dinámica molecular, para poder definir las especies presentes en disolución, sin ambigüedades. %&/MEMORIA %&/El aprendizaje durante el periodo de disfrute de la ayuda ha estado principalmente orientado hacia la elucidación de los equilibrios conformaciones de diferentes disacáridos y trisacáridos en disolución en estado libre y al estudio de los complejos resultantes de algunos de estos compuestos con sus receptores. %&/Concretamente, hacia la conformación de acetales cíclicos interglicosídicos en derivados C-glicosídicos, C-glicósidos derivados de galactosa, S-glicósidos derivados de la glucosa, otros análogos de trehalosa (C-Man-1,1-C-Gal) con un grupo hidroxilo o átomos de flúor en el puente, sobre un sufátido natural y su C-análogo correspondiente, el C-PSC de MenA y sobre el trisacárido mannosyl quitobiosa libre y el glicopeptido manosil quitobiosa asparragina libre y asociado.%&/RESULTADOS Y DISCUSIÓN%&/En el estudio de los diferentes disacáridos y trisacáridos los cálculos de mecánica molecular y dinámica molecular se han realizado utilizando los campos de fuerzas MM3*, MM2* y AMBER*, implementados en MACROMODEL 7.1 y MAESTRO 7.5. %&/Se han generando los mapas relajados de energía de los diferentes compuestos en los que se han delimitado los confórmeros de menor energía.%&/En el caso de las simulaciones de dinámica molecular, varias geometrías correspondientes a los diferentes mínimos de energía han sido utilizadas como estructura de partida.%&/La asignación de las señales de resonancia se ha realizado mediante la combinación de experimentos COSY, TOCSY, 1D y 2D-NOESY/ROESY, HSQC y HSQC-TOCSY.%&/En un segundo paso se han llevado a cabo experimentos NOESY y ROESY para deducir la información conformacional y chequear las predicciones obtenidas mediante cálculos computacionales y obtener así la distribución conformacional de cada uno de los compuestos en estudio. Para ello se ha utilizado un análisis cuantitativo de los efectos Overhauser nucleares de estas moléculas mediante la aproximación de los espines aislados y la aproximación de la matriz de relajación completa.%&/Siguiendo este protocolo se ha llevado a cabo, el análisis conformacional de todas las moléculas comentadas. %&/Los resultados obtenidos para acetales cíclicos interglicosídicos derivados C-glicosídicos, asi como para los otros análogos de trehalosa, indican que la geometría de estas moléculas depende fuertemente del tipo de sustitución química y de su orientación y que aunque se ha conseguido rigidificar en parte su estructrura ninguna de ellas parece capaz de mimetizar la conformación bioactiva de SLeX.%&/En el caso del sulfátido y su C-análogo correspondiente, los datos nos indican que el comportamiento conformacional en disolución para estos compuestos es muy similar, pero el compuesto sintético presenta movimientos locales más rápidos en la zona del enlace pseudo glicosídico lo que podria estar relacionado con su menor capacidad inmuno estimulante. %&/Los resultados obtenidos del estudio conformacional y su interacción con el anticuerpo correspondiente del C-PSC de MenA nos indican que estamos ante una molécula muy flexible en disolución, no pudiéndose determinar en este caso una selección conformacional del trisacarido por parte del anticuerpo en el complejo.%&/Por último se han realizado estudios de interacción entre las cadenas N-glicánicas de glicoproteínas y la heveína. Para ello se ha utilizado como ligando modelo el glicopeptido manosil quitobiosa asparragina. En un primer pasa se ha realizado el estudio conformacional del ligando libre tras el cual ha pasado al estudio del complejo carbohidrato proteina. El estudio de la interacción se monitorizó mediante una valoración seguida mediante RMN que permitió obtener la constante de asociación y los valores termodinámicos del proceso. Mediante la aplicación de metodología y aplicaciones de métodos modernos de modelización molecular de oligosacáridos y compuestos relacionados se abordó el estudio de la estructura tridimensional del complejo, concretamente cálculos de "docking" y de dinámica molecular solvatada utilizando para ello los programas de cálculo Autodock 3.05 y AMBER 8. Los resultados obtenidos de esta modelización han sido confirmados, de momento de forma cualitativa, mediante la observación de picos de cruce intermoleculares clave en el esprectro NOESY del complejo.